《Frontiers in Microbiology》：Discovery of penicillic acid from mangrove endophytic fungi: anti-Vibrio screening and cell envelope disruption in V. parahaemolyticus
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摘要
红树林内生真菌被认为是结构多样且具有生物活性的天然产物的丰富来源。在本研究中，从中国广西山口红树林自然保护区采集的红树林植物组织中分离并分类鉴定了19株可培养的内生真菌菌株。其中一株分离株Aspergillus sclerotiorum BM19对多种水
摘要
红树林内生真菌被认为是结构多样且具有生物活性的天然产物的丰富来源。在本研究中，从中国广西山口红树林自然保护区采集的红树林植物组织中分离并分类鉴定了19株可培养的内生真菌菌株。其中一株分离株Aspergillus sclerotiorum BM19对多种水生致病性弧菌表现出广谱抑制活性。通过生物活性指导的乙酸乙酯粗提物分级分离，研究人员分离获得青霉酸（penicillic acid，化合物1），其结构通过一维/二维核磁共振（1D/2D NMR）和高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）得到充分解析。青霉酸表现出强效的抗副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）活性，最低抑菌浓度（MIC）为6.25 μg/mL，且对人HaCaT角质形成细胞无明显细胞毒性。生长曲线测定显示浓度依赖性抗菌效应：0.5 × MIC延迟对数生长期，而1 × 和2 × MIC完全抑制细菌增殖。透射电子显微镜（TEM）在MIC浓度下观察到细胞变形、细胞包膜受损及细胞质泄漏，在2 × MIC浓度下观察到严重的包膜破坏。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合SYTO 9/PI双染色进一步证实了细胞包膜完整性的浓度依赖性损伤，表现为绿色荧光（完整细胞）减少和红色荧光（受损细胞）增加。综上所述，这些发现表明青霉酸抑制副溶血性弧菌，并与其浓度依赖性的细胞包膜完整性损伤相关。尽管青霉酸是一种已知的真菌毒素，但其对致病性弧菌的选择性活性及对人角质形成细胞的低毒性凸显了其作为水产养殖应用先导化合物的潜力。然而，在转化开发之前，仍需对体内效力和生物安全性进行系统的评估。
论文解读：红树林内生真菌来源青霉酸的抗弧菌活性及细胞包膜破坏机制研究
一、研究背景与目的
弧菌属（Vibrio）细菌是海洋和河口环境中广泛存在的革兰氏阴性菌，对生态环境、人类及动物健康构成日益严重的威胁。其中，副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、创伤弧菌（V. vulnificus）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）以及非O1/非O139霍乱弧菌（V. cholerae）是临床上重要的病原菌，主要经由海产品消费或海水接触引发人类胃肠炎、伤口感染和败血症。随着沿海水域变暖及海产品贸易扩张，致病性弧菌造成的公共卫生负担预计将持续上升。与此同时，弧菌病也是全球水产养殖中传播最广泛的细菌性疾病之一，对鱼类、对虾、贝类及软体动物养殖造成重大经济损失。以副溶血性弧菌引起的急性肝胰腺坏死病（AHPND）为例，该病已导致全球对虾养殖产量下降60%，造成约430亿美元的经济损失。尽管抗生素仍是疾病控制的主要手段，但过度使用已导致广泛的抗菌药物耐药性（AMR）、药物残留和生态失衡问题。研究表明，从进口海产品中分离的副溶血性弧菌分离株中，9.1%至少对一类抗生素耐药。因此，从环境友好且具有生物多样性的来源中寻找新型抗弧菌药物已成为当务之急。
天然产物长期以来一直是抗菌先导化合物的重要来源，海洋来源真菌因其化学多样性和生态适应性而备受关注。红树林生态系统独特的潮汐、高盐和缺氧环境对微生物施加强烈的选择压力，促进了其特化的代谢潜力，使红树林相关内生真菌成为结构多样的生物活性代谢产物的丰富生产者。然而，现有研究虽然涵盖了多肽类和小分子天然产物等多样化的抗弧菌候选物，但鲜有研究工作将菌株分离、靶向抗弧菌生物测定筛选、生物活性指导的活性分子纯化以及针对副溶血性弧菌的膜破坏表型表征整合在同一个研究流程中。特别是，青霉酸（penicillic acid）对副溶血性弧菌的抗弧菌活性及其相应的细胞包膜损伤表型，尚未在如此整合的筛选框架内得到充分表征。本研究旨在填补这一空白，从红树林内生真菌中分离鉴定目标菌株，纯化活性化合物，并通过表型成像技术揭示其对细菌细胞包膜完整性的影响，为水产养殖疾病管理提供安全有效的候选药物。
二、主要研究内容与结论
本研究从广西合浦山口红树林自然保护区采集的盐肤木（Rhus chinensis）植物组织中，通过表面消毒法和组织块培养法成功分离获得19株可培养的内生真菌菌株。基于形态学观察和内部转录间隔区（ITS）序列分析，构建了系统发育树，结果显示这些菌株归属于12个属，其中曲霉属（Aspergillus）为最优势属（6株，占31.6%），其次是拟青霉属（Paecilomyces）（15.8%）和青霉属（Penicillium）（10.5%），三个属合计占总分离株的57.9%，均属于散囊菌目（Eurotiales）。利用滤纸片扩散法对19株内生真菌的粗提物进行抗弧菌活性筛选，发现Aspergillus sclerotiorum BM19菌株对副溶血性弧菌、溶藻弧菌和澳氏弧菌（V. owensii）表现出最强且广谱的抑制活性。通过大规模固体发酵和乙酸乙酯提取，采用生物活性指导的分级分离策略，结合正相硅胶柱色谱、中压反相柱色谱和制备型高效液相色谱（preparative HPLC）等技术，从活性组分中纯化获得化合物1（286.5 mg）。通过一维/二维核磁共振（1D/2D NMR）和高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）数据分析，结合文献比对，将该化合物鉴定为青霉酸（penicillic acid，分子式C8H10O4）。此外，还分离鉴定了另外四个已知化合物，包括6-二氢-6-羟基青霉酸、5,6-二氢青霉酸、aspergerthinol A和aspergerthinol B。
采用微量肉汤稀释法测定了青霉酸对三种弧菌的最低抑菌浓度（MIC），结果显示其对副溶血性弧菌的抑菌活性最强，MIC为6.25 μg/mL，对澳氏弧菌和溶藻弧菌的MIC分别为12.5 μg/mL和25 μg/mL。基于副溶血性弧菌对药物最敏感，将其作为指示菌进行后续研究。生长曲线测定结果显示，空白对照组在2 h后迅速进入对数生长期并在12 h内达到峰值；0.5 × MIC处理显著抑制弧菌的对数生长；1 × 和2 × MIC处理在整个观察期间几乎完全抑制了副溶血性弧菌的生长，且OD600无显著增加，表明青霉酸以浓度依赖性方式抑制细菌生长。
三、主要技术方法
本研究采用的关键技术方法包括：第一，基于形态学观察与ITS rDNA序列分析的真菌分类鉴定方法，利用ITS1/ITS4通用引物进行PCR扩增并构建最大似然法（ML）系统发育树；第二，以纸片扩散法进行抗菌活性初步筛选的滤纸片琼脂扩散法；第三，生物活性指导的化合物分离纯化策略，综合利用正相硅胶柱色谱、中压反相柱色谱及制备型HPLC；第四，利用一维/二维核磁共振波谱（1D/2D NMR）和高分辨质谱（HRESIMS）进行结构解析；第五，生长曲线测定法评估药物对细菌增殖的浓度依赖性抑制效应；第六，透射电子显微镜（TEM）观察细菌超微结构形态变化；第七，SYTO 9/PI双荧光染色结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）定量评估细胞膜完整性；第八，MTT比色法检测化合物对人永生化角质形成细胞HaCaT的细胞毒性。
四、研究结果
3.1 红树林内生真菌的分离与鉴定
从红树林根部组织成功分离获得19株可培养真菌菌株，基于形态学观察和ITS rDNA序列分析构建系统发育树，结果显示19株分离株跨越12个属。其中曲霉属为最优势属（31.6%），包含A. terreus（BM3、BM10）、A. fumigatus（BM8）、A. hiratsukae（BM16）、A. versicolor（BM13）和A. sclerotiorum（BM19）六个菌株；拟青霉属次之（15.8%），包括三个同种菌株P. variotii（BM7、BM11、BM12）；青霉属位居第三（10.5%），包括P. malachiteum BM17和P. polonicum BM14。三个属合计占57.9%，证实散囊菌目是该红树林根系微生境中的优势真菌目。曲霉属及相关散囊菌目真菌在红树林根部的优势地位可能归因于其对周期性潮汐淹没、高盐、低氧和营养波动的独特红树林微环境具有强耐受性，以及强大的代谢可塑性。
3.2 Aspergillus sclerotiorum BM19具有产生抗弧菌活性化合物的更大潜力
采用纸片扩散法对19株内生真菌粗提物进行抗三种致病性弧菌活性筛选。结果显示抗菌活性存在显著的菌株依赖性差异。其中A. sclerotiorum BM19对副溶血性弧菌和澳氏弧菌的抑菌圈大于阳性对照诺氟沙星，表现出最强且广谱的抑制活性。此外，Talaromyces sp. BM18、Paecilomyces variotii（BM7和BM12）和Aspergillus versicolor BM13对三种受试病原菌均表现出中至强抑制活性。大多数其余菌株仅表现出弱活性或无活性。
3.3 基于抗弧菌活性指导的活性化合物纯化与表征
通过生物活性指导的分离策略，从A. sclerotiorum BM19的大规模稻米固体发酵乙酸乙酯提取物（214.4 g粗提物）中成功获得化合物1（286.5 mg），并被鉴定为青霉酸。同时分离鉴定了另外四个已知化合物。所有化合物的结构均通过1D/2D NMR和HRESIMS数据结合文献比对得到确证。
3.4 MIC与生长曲线
青霉酸对三种弧菌均表现出显著抑制作用，对副溶血性弧菌的MIC为6.25 μg/mL，对澳氏弧菌为12.5 μg/mL，对溶藻弧菌为25 μg/mL。生长曲线实验表明，0.5 × MIC显著抑制弧菌对数生长，1 × 和2 × MIC在12 h观察期内几乎完全抑制细菌增殖，呈明显的浓度依赖性。
3.5 化合物1对副溶血性弧菌细胞形态和膜完整性的影响
透射电子显微镜（TEM）观察显示，未处理的对照细胞呈典型短杆状形态，具有光滑连续的细胞表面和清晰的细胞轮廓。MIC处理组细胞出现明显结构损伤，包括细胞变形、细胞膜边缘破坏和部分胞内物质泄漏。2 × MIC处理组损伤更为严重，表现出显著的细胞变形、完全细胞膜裂解和大范围胞质成分外泄。SYTO 9/PI双染色结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进一步验证了膜完整性的剂量依赖性损伤：未处理对照组以明亮绿色荧光为主，几乎无红色信号；MIC处理后绿色荧光显著降低、红色荧光明显增加；2 × MIC处理组绿色荧光进一步减弱，红色荧光强度超过MIC处理组。定量分析显示，空白对照组PI阳性受损细胞比例仅为0.03 ± 0.01，1 × MIC处理后显著增加至0.24 ± 0.02，2 × MIC处理组进一步升高至45.0 ± 3.0%（p < 0.001），表明青霉酸以浓度依赖性方式破坏副溶血性弧菌的细胞包膜完整性。
3.6 HaCaT细胞毒性实验
MTT检测结果显示，在0.625～40 μM浓度范围内连续处理72 h后，青霉酸对各处理组HaCaT细胞增殖均未产生明显抑制作用。即使在40 μM最高测试浓度下，细胞活力仍保持在80%以上，与溶剂对照组相比无统计学显著差异，表明该化合物在实验浓度范围内对正常皮肤细胞毒性极弱。
五、讨论与结论
红树林内生真菌是生物活性次级代谢产物的宝贵资源库。本研究从红树林组织中分离的19株内生真菌中，曲霉属和青霉属为优势属，占全部分离株的42.1%，菌株BM19（初步鉴定为Aspergillus sclerotiorum）对三种水生致病性弧菌表现出突出的广谱抑制活性。青霉酸对副溶血性弧菌的MIC为6.25 μg/mL，与先前报道的多种海洋来源抗弧菌化合物相比显示出更强的活性或相当的效力。与抗菌肽类候选物相比，青霉酸作为小分子化合物在化学稳定性、可规模化生产及成本效益方面具有优势，但其固有的真菌毒素特性要求在实际水产养殖应用前进行严格的生物安全评估。透射电子显微镜和SYTO 9/PI双染色共聚焦激光扫描显微镜证实了青霉酸诱导的剂量依赖性细菌形态损伤和膜完整性破坏，这种独特的细胞包膜破坏表型将其与此前报道的抗弧菌候选物相区分。青霉酸处理2 h内即可观察到明显的细胞包膜损伤，符合膜干扰类抗菌药物快速起效的特征。值得注意的是，青霉酸对陆生病原菌（包括金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）仅表现出较弱抗菌活性（MIC 128～200 μg/mL），而其对水生弧菌的MIC值极低（6.25 μg/mL），表明其具有对特定革兰氏阴性水生病原菌的优先抑制倾向。
虽然透射电子显微镜和共聚焦显微镜清晰可视化了膜损伤表型，但形态学证据本身无法区分直接的化合物-膜相互作用与细胞内亲电或氧化应激触发的继发性膜损伤。鉴于青霉酸是一种亲电性真菌毒素，这类继发性应激诱导效应构成合理的替代机制解释。MTT实验显示青霉酸在有效抗菌浓度范围内（0.625～40 μM）对真核细胞的毒性可忽略不计，表明非特异性亲电毒性不太可能是观察到的膜损伤的主要原因。然而，直接膜靶向机制的明确验证仍需进一步的生物物理证据。
研究结论：本研究从红树林内生真菌Aspergillus sclerotiorum BM19中分离获得青霉酸，并验证了其对多种致病性弧菌具有广谱、剂量依赖性的抑菌活性，形态学证据表明其具有细胞包膜破坏作用。青霉酸与大多数已报道的海洋来源小分子抗菌化合物相比具有竞争力的抗弧菌效力，其小分子特性赋予其优异的化学稳定性和可规模化生产潜力。未来研究将聚焦于化合物与膜直接相互作用的生物物理验证、潜在分子机制的系统阐明，以及体内效力和生物安全性的综合评价。
