中红外显微镜用于无标记数字染色：初步临床评估

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Mid-infrared microscopy for label-free digital staining: initial clinical assessment

　　

红外（IR）显微镜在解剖病理学中显示出用于无标记组织成像的巨大潜力，能够提供丰富的生化对比度。然而，现有红外成像技术受限于采集速度慢和空间分辨率有限。在此，研究人员提出了一种快速、大视场双模态成像平台，该平台将传统明场显微镜与无透镜红外成像扫描仪相结合，可在数分钟内完成全切片红外图像堆栈采集。通过专用的深度学习模型，研究人员实现了基于亚细胞形态-光谱指纹的光学H&E染色策略。该方法无需化学染色即可实现组织架构的高分辨率可视化，有效空间分辨率为500 nm。定量指标，包括峰值信噪比（PSNR，约24）、多尺度结构相似性（MS-SSIM，约0.82）和学习感知图像块相似性（LPIPS，约0.22），验证了模型准确再现细胞结构对比度和形态的能力。此外，对5个组织切片内110个感兴趣区域的初步临床评估表明，基于红外的人工智能染色在图像质量和Gleason分级方面与传统化学染色具有等效性。综上，这些结果表明，这种基于红外的虚拟染色方法可为解剖病理学工作流程提供一种快速、无化学试剂的替代方案。

**论文解读：基于中红外显微镜的无标记数字染色及其初步临床评估**

**1. 研究背景与问题**

解剖病理学是疾病诊断的基石，其标准流程包括组织固定、包埋、切片及苏木精-伊红（H&E）染色，再由病理医师在显微镜下观察细胞与组织结构异常。H&E染色是约95%癌症诊断的第一步。然而，当前病理学领域面临三大挑战：检测需求持续增长、每项检测的信息量增大、诊断误差需最小化，同时病理医师和技术人员严重短缺。数字病理学通过全切片扫描和人工智能（AI）辅助分析有望提升效率，但传统化学染色和数字扫描存在步骤繁琐、耗时、批次差异等局限。无标记成像技术，特别是虚拟染色，近年来成为研究热点，旨在通过计算方式模拟传统染色效果。现有虚拟染色方法主要依赖明场（BF）或荧光图像，受限于形态学特征分析，对细胞核的还原不够精确，且缺乏生化对比信息。红外（IR）显微镜能提供丰富的分子振动光谱信息，但受制于采集速度和空间分辨率，尚未进入临床实践。因此，开发一种兼顾速度、分辨率与生化信息的无标记数字染色方法具有重要意义。

**2. 研究目的与方法概述**

本研究旨在建立一种基于中红外显微镜和深度学习的新型数字H&E染色平台，实现无需化学染料的快速全切片成像，并为前列腺癌的病理诊断提供等效于传统染色的图像质量。研究人员采用双模态成像框架，将常规明场显微镜与自制的无透镜中红外扫描仪相结合，采集未染色组织的16波长IR图像堆栈和明场图像，随后对同一组织进行化学H&E染色并采集相应明场图像作为金标准。通过专用的注意力多模态UNet（AttMUNet）生成器和PatchGAN判别器构成的MUGAN模型，融合形态学与光谱特征，生成数字H&E染色图像。研究队列包括15例前列腺癌患者的15个3 μm厚福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，沉积于氟化钙（CaF₂）玻片上。模型训练采用10例患者样本，测试采用5例独立患者样本，确保严格的样本外评估。定量评估采用PSNR、SSIM、MS-SSIM和LPIPS指标；临床评估由两名病理医师对109个感兴趣区域（ROI）进行图像质量评分和Gleason分级。

**3. 研究结果**

**3.1 定性结果**
研究人员展示了组织切片在核酸（1,041 cm^-1核糖振动、1,241 cm^-1磷酸二酯振动）和蛋白质（1,641 cm^-1/1,556 cm^-1酰胺I/II振动）波长的IR图像。数字H&E染色图像与化学H&E染色在细胞形状、核仁、腺体、血管结构、结缔组织及色彩对比度上高度一致，尤其核和核仁的再现较为准确，验证了双模态数据融合的有效性。

**3.2 定量结果–指标**
在测试数据集（13,073个补丁）上计算图像质量指标，得到SSIM为0.78±0.057，MS-SSIM为0.82±0.072，PSNR为23.71±2.454，LPIPS为0.039±0.039。与现有文献相比，PSNR高于多数基于明场或自体荧光的虚拟染色方法，SSIM与MS-SSIM表明模型较好地保持了组织架构。消融实验显示，融合IR光谱数据相比仅用BF图像，SSIM从0.746提升至0.780，PSNR从22.87 dB提升至23.71 dB，证明光谱信息对染色性能有增益作用。

**3.3 统计分析–临床前验证**
两名病理医师对109个ROI的推断图像和真实化学H&E图像进行双盲交叉评分。图像质量方面，推断ROI的细胞核、细胞质和胶原评分与真实H&E大体相近，但细胞核评分的统计学检验（χ²检验）在P1中显示存在显著差异（p=0.0012），提示核渲染仍可优化；细胞质在P2中也存在差异（p=0.0025）。胶原评分无显著差异。Gleason分级方面，病理医师对推断图像和真实图像的分级一致性分别达到88%和87.2%，χ²检验无显著差异（p=0.890和p=0.515），证明数字染色与化学染色在前列腺癌分级上具有诊断等效性。此外，病理医师内部的一致性分别为86.2%（真实图像）和84.4%（推断图像），模型与金标准的平均一致性88%略高于典型病理医师内部的一致性（约85%）。

**4. 讨论与结论**

讨论部分指出，本研究的双模态架构类似于詹姆斯·韦伯太空望远镜融合高分辨率近红外结构数据与低分辨率中红外光谱数据的策略，利用BF图像的亚微米形态边界来解析IR堆栈的粗粒化生化像素（8 μm）。该技术能够在几分钟内获取5 cm²组织的IR-WSI，满足病理工作流程的时间要求。尽管定量指标和临床评估结果积极，但核的准确渲染仍是改进方向。未来工作包括提高IR空间分辨率以增强核检测，将生成器从CNN替换为视觉Transformer架构，并将模型扩展至结肠、乳腺和皮肤等组织。研究人员还计划将代谢组学图谱（如胶原、脂质、碳水化合物和增殖标志物）叠加到数字H&E图像上，以挖掘更丰富的诊断和预后分子标记。总之，本研究证明基于中红外的数字染色可为解剖病理学提供快速、无化学试剂的等效替代方案，为红外光谱在临床病理中的标准化应用奠定了基础。