《Frontiers in Immunology》：Vaccination of newborn monkeys with an influenza HA stem nanoparticle adjuvanted with R848 and AddaVax results in broadened HA recognition and increased antibody secreting cells to HA stem following H1N1 challenge
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背景：在已有流感病毒血凝素（hemagglutinin, HA）茎部聚焦免疫的情况下，感染如何塑造回忆应答具有重要意义，因为已知印记作用会影响未来的免疫应答。对婴儿采用基于HA的通用茎部疫苗策略很可能会导致茎部特异性印记。因此，了解印记如何编程记忆B细胞回忆以
背景：在已有流感病毒血凝素（hemagglutinin, HA）茎部聚焦免疫的情况下，感染如何塑造回忆应答具有重要意义，因为已知印记作用会影响未来的免疫应答。对婴儿采用基于HA的通用茎部疫苗策略很可能会导致茎部特异性印记。因此，了解印记如何编程记忆B细胞回忆以及新生儿中针对HA茎部和头部的早期抗体应答至关重要。方法：新生非洲绿猴接种以R848+AddaVax为佐剂的A/New Caledonia/20/1999（NC99）HA茎部纳米颗粒（H1ssF），随后用H1N1 A/California/07/2009（Ca09）攻毒。在攻毒后第7天（d7）分析抗体和引流淋巴结细胞应答。对抗体应答的定量和定性特征均进行了评估。结果：研究人员先前的研究显示，接种R848+AddaVax双佐剂H1ssF纳米颗粒的新生非洲绿猴表现出强健的茎部特异性抗体应答，该应答具有广泛反应性和增强的功能活性。在本研究中，研究人员调查了该疫苗诱导的应答在感染后如何被回忆，同时评估了抗体和细胞应答。虽然攻毒导致对多种异源HA分子的识别增加，但并非所有应答在该时间点均显示增强的证据。对照（Ctrl）动物在感染后d7对Ca09的中和活性有限，而攻毒导致针对攻毒病毒的中和抗体显著增加。与Ctrl动物相比，接种疫苗的幼猴表现出较低的生发中心B细胞应答和产生IFNγ的滤泡辅助性T细胞（T follicular helper, Tfh）应答。然而，接种疫苗的幼猴在肺引流气管支气管淋巴结中表现出HA茎部特异性浆母细胞和浆细胞显著增加，同时头部特异性应答相似。结论：总的来说，这些发现与新生非洲绿猴接种双佐剂H1ssF后针对流感病毒攻毒产生的高效茎部特异性回忆应答一致。有趣的是，异源病毒攻毒似乎重塑了茎部特异性应答的反应性谱。此外，接种疫苗的动物表现出强健的早期抗体分泌细胞应答，包括茎部特异性细胞数量增加，而头部特异性细胞的产生没有明显减少。
婴儿期免疫系统处于发育阶段，对流感病毒等呼吸道病原体高度易感。六个月以下婴儿感染甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）后住院率显著升高，而这一年龄组目前尚无许可的流感疫苗。现有流感疫苗诱导的抗体主要针对血凝素（hemagglutinin, HA）头部，该区域是抗原漂移的主要位点；针对HA茎部的抗体虽然具有广谱反应性，但通常处于亚显性状态。因此，基于HA茎部的通用流感疫苗策略有望为婴儿提供更广谱的保护。研究人员先前已证明，使用TLR7/8激动剂R848与角鲨烯水包油纳米乳剂AddaVax组成的双佐剂HA茎部纳米颗粒疫苗（H1ssF）免疫新生非洲绿猴，可诱导强效的茎部特异性多功能抗体，并降低H1N1攻毒后的肺病毒载量。然而，在已有HA茎部聚焦免疫的情况下，感染如何回忆并重塑这种免疫记忆，以及它如何影响早期针对HA茎部与头部的B细胞应答，尚不清楚。本研究针对这一问题展开，相关论文发表于《Frontiers in Immunology》。
研究人员开展的实验内容为：新生非洲绿猴接种H1ssF-R848+AddaVax或对照制剂，随后以异源H1N1病毒A/California/07/2009（Ca09）攻毒，在攻毒后第7天（d7pc）系统分析了血浆抗体广度与功能、骨髓抗体分泌细胞（antibody secreting cell, ASC），以及肺引流气管支气管淋巴结（tracheobronchial lymph node, TBLN）中生发中心（germinal center, GC）B细胞、Tfh细胞、浆母细胞（plasmablast, PB）和浆细胞（plasma cell, PC）的变化。
关键技术方法方面，研究使用了以下方法：ELISA检测血浆对多种HA分子的结合广度；基于复制受限报告病毒的中和试验测定中和抗体滴度；通过流式细胞术检测抗体依赖性细胞毒（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）和抗体依赖性补体沉积（ADCD）；利用流式细胞术对TBLN中HA头部和茎部特异性B细胞亚群进行表征；采用ELISpot检测骨髓中茎特异性IgG ASC。样本来源为新生非洲绿猴，对照组（n=9）由PBS、荧光素酶mRNA-LNP或非佐剂H1ssF组构成，疫苗组（n=7）为H1ssF-R848+AddaVax组。
研究结果如下：
3.1 新生猴接种H1ssF-R848+AddaVax后攻毒可增强对多种但非所有HA亚型的反应性
通过ELISA检测d7pc血浆中针对不同HA亚型的IgG结合抗体，发现疫苗接种动物对H1（NC99、Ca09）、H2和H9的识别显著增强，但对H5的识别未显著增强。这表明Ca09攻毒并非均匀增强所有茎部反应性，而是改变了疫苗诱导的HA反应谱。
3.2 接种动物骨髓中存在茎特异性IgG抗体分泌细胞
采用ELISpot检测d7pc骨髓中的茎特异性IgG分泌细胞。对照组动物未检测到明显应答，而H1ssF-R848+AddaVax组中除一只动物外均检测到茎特异性IgG分泌细胞。这提示疫苗诱导了骨髓中长期存活的ASC，也可能包含攻毒后早期由记忆B细胞快速分化的细胞。
3.3 接种动物对Ca09攻毒病毒具有更高的中和抗体
利用报告病毒微中和试验评估针对Ca09（H1N1）、NC99（H1N1）和A/Vietnam/1203/2004（H5N1）的中和活性。d7pc时，接种组对Ca09的中和抗体显著升高，对NC99和H5N1的中和滴度也高于对照组，但未达到统计显著。攻毒后7天内，ADCC、ADCP和ADCD活性在接种组中未显著增加，而对照组仅ADCP在感染后达到与接种组相近的水平，说明早期回忆应答主要增强了中和抗体轴。
3.4 与对照组相比，接种新生猴在d7pc生发中心反应证据有限
通过流式细胞术分析TBLN中HA头部（H1+H5-）和茎部（H1+H5+）特异性GC B细胞（IgG+CD20+BCL-6+）及Tfh细胞（CD3+CD4+PD-1hiBCL-6+FoxP3-）。结果显示，接种动物中头部特异性GC B细胞比例显著低于对照组（下降约4.6倍），而茎特异性GC B细胞比例在两组间无显著差异。用Ca09 HA肽库刺激后，对照组Tfh细胞中IFNγ+细胞比例显著高于接种组。这说明在d7pc这一早期时间点，疫苗诱导的茎部记忆可能更多趋向ASC分化，而非进入新的GC反应。
3.5 接种新生猴具有更高的茎特异性浆母细胞和浆细胞
进一步对TBLN中PB（CD20-IgG+CD38+Ki-67+）和PC（CD20-IgG+CD38+Ki-67-）进行分析，发现接种组中茎特异性PB和PC比例显著高于对照组，且茎特异性细胞在总HA特异性PB/PC中占比更高。此外，接种组中茎特异性细胞更倾向于PC分化，而头部特异性PB和PC在两组间无显著差异。这表明疫苗诱导的茎特异性记忆能够被有效召回，且未削弱感染诱导的头部特异性ASC生成。
讨论部分指出，本研究有五个主要发现：疫苗诱导的抗体在攻毒后具有更广的HA反应性；接种动物对挑战病毒的中和能力更强；茎特异性记忆被快速召回，表现为TBLN中PB和PC增加；同时GC B细胞和IFNγ+ Tfh反应在d7pc减少；头特异性ASC反应不受影响。作者认为，接种动物中GC反应的减少可能与记忆B细胞快速分化为ASC、疫苗诱导的抗体对共享茎部表位的遮蔽，以及病毒载量较低等因素有关，但这些机制仍需进一步研究验证。研究结论部分可翻译为：总之，在病毒攻毒情况下维持并增强广谱反应性抗体应答，将是采用基于茎部的通用流感疫苗策略的关键方面。与AddaVax作为唯一佐剂时观察到的回忆反应相似，HA茎部疫苗接种对早期产生茎特异性抗体分泌细胞具有有益影响。这些数据拓展了研究人员对新生猴接种H1ssF-R848+AddaVax后攻毒所产生早期回忆反应的理解，并进一步揭示了茎部限制性记忆应答如何影响病毒攻毒所诱导的HA头部应答。
