《Frontiers in Plant Science》：Comparative genomics and phylogenetic analysis of three Malvaceae species on the basis of chloroplast genomes
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摘要
引言：锦葵科（Malvaceae）植物物种多样性丰富，具有重要的经济和药用价值。然而，该科成员间频繁的种间杂交导致类群间的系统发育关系混淆不清，限制了传统分类方法的应用。方法：本研究通过评估23个叶绿体（chloroplast, CP）基因组（包括3个新
摘要
引言：锦葵科（Malvaceae）植物物种多样性丰富，具有重要的经济和药用价值。然而，该科成员间频繁的种间杂交导致类群间的系统发育关系混淆不清，限制了传统分类方法的应用。方法：本研究通过评估23个叶绿体（chloroplast, CP）基因组（包括3个新组装的CP基因组）来探究锦葵科选定类群的系统发育关系。在这3个基因组中，裂瓣槿（Hibiscus schizopetalus L.）的CP基因组为首次报道，而蜀葵（Alcea rosea L.）和樟叶槿（Hibiscus grewiifolius L.）的CP基因组虽已收录于NCBI，但本研究将其与新生成的数据一并进行了重新分析以达到比较目的。此外，研究人员还利用全CP基因组数据中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）对涵盖13个属的20个下载的CP基因组进行了分析。结果：结果表明，这些基因组长度为160,403至161,978个碱基对，由两个反向重复序列（inverted repeat, IR）分隔的小单拷贝区（small single copy, SSC）和大单拷贝区（large single copy, LSC）组成，形成典型的四分体环状结构。全基因组序列在结构、GC含量、密码子使用和基因组成方面表现出跨物种的相对保守性。突变位点主要分布于LSC和SSC区域，且非编码区的变异性高于编码区。核苷酸多态性（nucleotide polymorphism, Pi）分析鉴定出ndhF-rpl32和psbZ-trnG等非编码区为高变异热点区域。基于全CP基因组数据中的SNP构建了最大似然（maximum likelihood, ML）系统发育树。系统发育分析将这23个物种划分为5个高支持率的支系。分析结果还揭示了秋葵属（Abelmoschus）与木槿属（Hibiscus）物种间密切的姐妹群关系，表明木槿属可能与秋葵属物种存在独立的谱系。讨论：总之，CP基因组资源的日益丰富将增进研究人员对锦葵科分类和进化模式的理解。分子标记的开发将为该科植物的精准鉴定和分类修订提供重要的分子证据。
论文解读
一、研究背景与科学问题
锦葵科（Malvaceae）包含约4,225个物种，广泛分布于全球热带、亚热带和温带地区，具有极高的观赏、经济、食用及药用价值。该科植物形态多样，包含草本、灌木乃至乔木，其花大色艳，叶片多具掌状脉和托叶。然而，该科植物种间杂交频繁，导致类群间的亲缘关系混乱，尤其是木槿属（Hibiscus）的系统位置及其与近缘类群的界限问题长期存在争议，传统分类方法在解决这些问题上存在局限。尽管叶绿体（chloroplast, CP）基因组凭借其母系遗传、结构保守和进化速率适中等优势，已成为解决植物系统发育关系的强有力工具，但现有研究多集中于个别物种或特定分支，缺乏对科内多个属的系统采样和整体分析。此外，多数研究在比较分析中未能充分纳入近缘外类群，导致系统发育框架相对狭窄（原文无直接对应表述），降低了系统发育推断的稳健性。因此，本研究旨在通过补充关键物种的CP基因组数据，在更广泛的系统发育背景下探究锦葵科选定类群的进化关系，为分类修订、物种鉴定和分子标记开发提供基因组学证据。
二、研究内容与结论
研究人员选取了蜀葵（Alcea rosea L.）、裂瓣槿（Hibiscus schizopetalus L.）和樟叶槿（Hibiscus grewiifolius L.）三个代表性物种，结合NCBI数据库中下载的20个覆盖13个属的锦葵科CP基因组以及3个近缘外类群，共计23个物种进行了系统比较分析。其中，裂瓣槿的CP基因组为首次报道，蜀葵和樟叶槿的CP基因组虽已存在于NCBI，但本研究对其进行重新分析以达到比较目的。研究成功组装并注释了三个新测序物种的完整CP基因组，发现其长度分别为160,403 bp、160,493 bp和161,978 bp，GC含量在36.81%至37.04%之间，均呈现典型的四分体结构。比较基因组分析揭示了锦葵科CP基因组在基因组成、序列和整体结构上的高度保守性，但在反向重复区（IR）与单拷贝区（SC）边界存在显著的收缩和扩张现象，其长度差异可达3,055 bp，这是导致基因组大小变异的主要因素。重复序列分析鉴定了大量简单重复序列（SSR）和长重复序列，其中单核苷酸重复、正向重复和回文重复为主要类型，且多数富集于大单拷贝区（LSC）和基因间隔区（IGS）。核苷酸多态性（Pi）分析确定了ndhF-rpl32、psbZ-trnG-GCC和trnR-UCU-atpA等多个高变异热点区域，这些区域可作为潜在的超级条形码候选标记。密码子使用偏好分析显示，所有物种的密码子使用模式相似，亮氨酸使用频率最高，半胱氨酸最低，且密码子使用偏好受突变压力和自然选择的共同影响，但不同物种间两种因素的相对贡献存在差异。选择压力分析表明大多数基因处于纯化选择之下，但在三色槿（Hibiscus syriacus L.）的trnH-psbA区域检测到显著的正选择信号（Ka/Ks比值约为4.0）。基于全CP基因组SNP构建的最大似然（ML）系统发育树将23个物种分为5个高支持率支系，清晰揭示了木槿属与秋葵属物种间的密切姐妹群关系，为将秋葵属并入木槿属的分类修订提议提供了强有力的分子证据。
三、主要技术方法
本研究使用了以下关键技术方法：（1）采用Illumina NovaSeq平台对三个物种进行双端测序，结合NOVOPlasty 4.2等工具进行CP基因组的组装和GapCloser填补；（2）利用CPGAVAS2和tRNAscan-SE进行基因组注释，并使用Organellar Genome DRAW绘制CP基因组图谱；（3）通过IRscope分析IR/SC边界动态，利用MISA和REPuter分别鉴定SSR和长重复序列；（4）运用Mauve软件进行共线性分析，通过mVISTA和DNASP 6进行基因组序列比对和核苷酸多态性计算；（5）利用RSCU-Plot、KaKs_Calculator分别进行密码子使用偏好和选择压力分析；（6）基于MAFFT比对和PhyML构建ML系统发育树。植物材料采集自河北省林业科学研究院（经度114°47'，纬度38°05'），下载的20个CP基因组来自NCBI公共数据库。
四、研究结果
3.1 三个锦葵科物种CP基因组的基本特征：成功组装了蜀葵、裂瓣槿和樟叶槿的完整CP基因组，三者均呈现典型的四分体结构，长度介于160,403至161,978 bp之间，GC含量为36.81%-37.04%。所有基因组均包含114个独特基因（4个rRNA基因、30个tRNA基因和80个蛋白质编码基因），由于IR区的存在，基因总数为130个。
3.2 IR/SC边界比较与基因组长度变异分析：对15个锦葵科物种的IR/SC边界进行比较后发现，IR/SC边界的动态收缩和扩张是导致基因组长度变异的主要因素。ycf1基因侧的边界扩张（最大重叠908 bp）远大于ndhF基因侧（最大重叠32 bp），表明该边界具有较高的可塑性。
3.3 长重复序列和SSR分析：在15个物种中鉴定出63至119个SSR，其中单核苷酸重复最为丰富，且主要分布于LSC区和IGS区。研究还鉴定出39至225个长度不低于30 bp的长重复序列，以正向重复和回文重复为主，这些重复序列为物种鉴定和进化动态研究提供了潜在的分子标记。
3.4 比较基因组学分析：共线性分析显示所有物种的CP基因组具有极高的共线性，大多数同源基因簇排列线性、有序且方向一致，未检测到大规模重排、倒位或易位事件。
3.5 比较基因组和核苷酸多态性分析：全基因组核苷酸多态性分析揭示了基因组内变异强度的显著波动，鉴定出ndhF_rpl32、psbZ_trnG-GCC和trnR-UCU_atpA等高变异热点区域。通过比较基于不同区域构建的进化树发现，ndhF_rpl32区域与全基因组树的聚类最为一致，被确认为具有代表性的多态性区域。
3.6 密码子使用偏好：密码子使用分析显示亮氨酸是使用频率最高的氨基酸，半胱氨酸频率最低。30个密码子的RSCU值小于1，29个大于1，且偏好以G/C结尾的密码子，表明CP基因组蛋白质编码基因的密码子使用存在一定偏好性。
3.7 选择压力分析：Ka/Ks分析显示大多数基因处于强纯化选择约束之下，但在三色槿的trnH-psbA区域检测到显著的正选择信号（Ka/Ks约为4.0），提示该基因可能在三色槿中经历了适应性进化。
3.8 锦葵科植物的系统发育分析：基于23个物种的全CP基因组SNP构建的ML系统发育树将所有物种划分为5个主要支系。基础支系包括可可（Theobroma cacao）、扁担杆（Grewia biloba）和长蒴黄麻（Corchorus olitorius），而核心锦葵科支系包含了木槿属和秋葵属的所有物种。分析结果清晰显示秋葵属物种嵌套于木槿属支系内，高支持率地支持了将秋葵属并入木槿属的分类修订提议。
五、讨论与结论
本研究通过系统的比较基因组学分析，证实了锦葵科CP基因组在宏观结构上的高度保守性和局部区域的动态进化特征。IR/SC边界的收缩与扩张是驱动基因组长度变异的主要结构因素，且与重复序列的分布特征密切相关。高变异区域的鉴定为开发适用于锦葵科近缘种鉴定的超级条形码提供了候选标记。基于完整CP基因组构建的系统发育树以极高的支持率解决了木槿属及其近缘类群的系统发育关系，明确了秋葵属与木槿属的密切亲缘关系，为分类修订提供了坚实的分子系统学基础。传统的单一DNA条形码（如matK、rbcL和trnH-psbA）在近缘种鉴定中分辨率有限，而基于全基因组信息筛选的特定高变异区域呈现出更高的分辨率。本研究不仅丰富了锦葵科的CP基因组资源，为该科的物种鉴定、分类修订和分子标记开发提供了可靠的基因组学基础，也为深入理解该科的适应性进化和群体遗传学研究奠定了重要基础。
