《Frontiers in Microbiology》：Macrophomina phaseolina expresses sequential waves of effector, secondary metabolite, and CAZyme genes during strawberry infection, suggesting a hemibiotrophic lifestyle
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菜豆壳球孢（Macrophomina phaseolina）引起草莓（Fragaria×ananassa）冠腐病和根腐病，并随着全球草莓产区气温升高而造成的危害日益加重。关于菜豆壳球孢侵染草莓期间的分子事件，如升高的温度和不同侵染阶段的转录变化，目前知之甚少。
菜豆壳球孢（Macrophomina phaseolina）引起草莓（Fragaria×ananassa）冠腐病和根腐病，并随着全球草莓产区气温升高而造成的危害日益加重。关于菜豆壳球孢侵染草莓期间的分子事件，如升高的温度和不同侵染阶段的转录变化，目前知之甚少。为填补这一知识空白，研究人员分析了在受控环境中高（30°C）和低（23°C）昼温条件下生长的草莓植株在菜豆壳球孢侵染期间的转录变化。在高温条件下，与低温培养的植株相比，植株表现出更严重的冠部/根部坏死、萎蔫以及加速的病害进程。基于温度处理的联合分析，菜豆壳球孢和草莓的转录变化受病害阶段影响显著，每个阶段具有特定基因类别独特的表达模式。在菜豆壳球孢中，效应蛋白编码基因在病害早期高度富集并表达，而次级代谢物编码基因在侵染中期的坏死营养阶段高度上调。碳水化合物活性酶（CAZyme）的表达在侵染后期富集。这些基因富集和表达模式表明菜豆壳球孢在草莓侵染期间具有半活体营养型生活方式。在高温条件下，菜豆壳球孢致病性相关基因上调，而草莓免疫相关基因下调，表明该处理下病害严重程度的增加至少部分归因于与感病性相关的植物反应。该研究首次利用转录组学表征了菜豆壳球孢-草莓互作，并探究了高温影响菜豆壳球孢致病的机制。
论文解读：菜豆壳球孢-草莓互作的转录组学分析揭示其半活体营养型生活史及高温加速致病的分子机制
一、研究背景与科学问题
植物病原真菌根据其获取营养时宿主细胞的存活状态可分为三大类群：活体营养型（biotroph）、死体营养型（necrotroph）和半活体营养型（hemibiotroph）。活体营养型病原菌从活体宿主细胞中获取营养，通常分泌较少的细胞壁降解酶（CWDEs）且一般不产生毒素；死体营养型病原菌则通过分泌毒素、诱导宿主细胞死亡的效应蛋白、促进宿主活性氧（ROS）产生以及分泌大量CWDEs来杀死宿主细胞并获取营养；半活体营养型则兼具两种生活方式的特征，在侵染初期有一段不杀死宿主细胞的活体营养阶段，随后转换为死体营养阶段。
菜豆壳球孢（Macrophomina phaseolina）长期以来被认定为一种死体营养型真菌，可侵染广泛的植物宿主，在全球干旱和温暖地区造成严重危害。近年来，该病原菌已成为全球草莓（Fragaria×ananassa）生产中日益严重的问题，引起的冠腐病和根腐病导致植株死亡和产量显著下降。对菜豆壳球孢高度抗性的草莓基因型极为稀有，仅占野生和栽培种质的1%。草莓根部无症状侵染与地上部症状出现之间可能存在较长的间隔期，这暗示病原菌首先在植物体内进行无症状定殖，当环境条件有利于致病时才表现病害。高温可增加菜豆壳球孢在草莓上引起的病害严重程度，30°C的土壤高温可增加植株死亡率。然而，菜豆壳球孢侵染草莓期间的分子互作机制尚未被表征，高温影响致病过程的转录组基础也不清楚。一项在芝麻上的研究曾挑战菜豆壳球孢是死体营养型真菌的传统观点，发现其早期侵染事件具有活体营养特征，随后转换为死体营养型基因表达，但该研究仅关注了有限的宿主和病原菌基因。鉴于菜豆壳球孢基因组中含有大量与死体营养型生活方式相关的CWDE编码基因和次级代谢物基因，亟需在全转录组水平系统解析菜豆壳球孢-草莓互作过程中的分子事件，并阐明高温促进病害的分子机制。
二、研究内容概述
研究人员开展了这项研究，在受控环境中设置高温（30°C白天/25°C夜间）和低温（23°C白天/18°C夜间）两种温度 regime，以高感草莓品种 Monterey（试验1）和 San Andreas（试验2）为材料，接种菜豆壳球孢 F005 分离株，在接种后 1、5、12、21 天采集根部和真菌组织，进行病程评估、显微观察和 RNAseq 转录组分析。研究发现高温显著加速了病害进程，导致更严重的冠腐和根腐坏死。转录组分析表明，菜豆壳球孢和草莓的转录变化主要受病害阶段影响。在菜豆壳球孢中，效应蛋白编码基因在病害早期高度富集表达，次级代谢物编码基因在侵染中期（坏死营养阶段）高度上调，CAZyme 表达在侵染后期富集，这些基因的阶段性表达模式表明菜豆壳球孢在草莓侵染期间具有半活体营养型生活方式。在高温条件下，菜豆壳球孢致病性相关基因上调表达或提前诱导，而草莓免疫相关基因下调，揭示了高温加重病害的部分机制。该研究首次从转录组水平表征了菜豆壳球孢-草莓互作，为理解高温影响病原菌致病的机制提供了新见解。论文发表在《Frontiers in Microbiology》。
三、主要关键技术方法
该研究采用了以下关键技术方法：（1）受控环境生长箱实验：设置高（30°C/25°C）和低（23°C/18°C）两种温度 regime，两个品种共进行两次独立试验；（2）病害严重度评估与病害阶段划分：基于地上部症状（1-5级评分）结合根和冠部坏死情况，将样品划分为早期侵染、中期侵染、晚期侵染和腐生营养四个阶段；（3）显微观察与微菌核定量：采用 KOH 透明、乳酸酚蓝染色法观察根组织内黑色微菌核并计算密度；（4）RNAseq 转录组测序：使用 Lexogen QuantSeq 3' mRNA-Seq 文库制备试剂盒进行测序，通过双参考基因组比对，分别分析病原菌和宿主的基因表达；（5）生物信息学功能注释：利用 SignalP、EffectorP 预测效应蛋白，dbCAN 预测 CAZymes，antiSMASH 预测次级代谢物基因；（6）差异表达基因分析：使用 edgeR、limma 等工具进行差异表达分析、主成分分析和基因富集分析。
四、研究结果
3.1 高温与更严重的坏死和更快的病害进程相关
通过联合分析两次试验的数据，研究人员发现高温处理在接种后 12 天和 21 天时，接种植株表现出更严重的根部和冠部坏死以及加速的植株死亡（Wilcoxon 秩和检验 P < 0.001）。高温下的 AUDPC 值显著增大，表明该处理下病害发病更迅速。微菌核密度仅在 21 天时存在显著温度差异，且微菌核密度与病害阶段显著正相关（Spearman p < 0.001，ρ = 0.83），但与病害评分和温度无显著相关。
3.2 病害阶段对菜豆壳球孢和草莓转录组差异起主要影响
W*d 检验表明，病害阶段解释了菜豆壳球孢转录组最大的方差（FDR-adjusted p = 0.002，ω2 = 0.49），同一病害阶段的样品在 PCA 图中聚在一起。温度也显著影响菜豆壳球孢的转录变化（ω2 = 0.37）。在草莓转录组中，病害阶段同样解释了最大的方差（ω2 = 0.39），温度和草莓基因型的影响显著但效应较小（ω2 分别为 0.02 和 0.07）。试验（品种）对菜豆壳球孢转录组无显著影响，因此合并两次试验的数据进行分析。
3.3 菜豆壳球孢差异表达基因表现出病害阶段特异性富集
共鉴定到 3,539 个病害阶段间的差异表达基因（DEGs），其中 1,778 个 DEGs 被明确分配到特定病害阶段。聚焦于效应蛋白、次级代谢物和 CAZyme 三类基因，共筛选出 359 个在植物内上调且具有阶段特异性表达的 DEGs。早期侵染阶段，效应蛋白编码基因显著富集（Fisher 精确检验 p < 0.01）并高度上调表达，包括具有双质外体/细胞质定位预测的效应蛋白以及含 LysM 结构域和 CAP 结构域的效应蛋白。早-中期、中期和中期-晚期阶段以次级代谢物生物合成基因的显著富集表达为特征。晚期侵染阶段，CAZyme 编码基因表现出最大程度的上调和富集（p < 0.01），同时质外体效应蛋白也出现富集和上调峰值，其中大部分同时被归类为 CAZymes。在腐生营养阶段，许多 CAZymes 和部分次级代谢物基因仍表达但水平下降。这些结果支持菜豆壳球孢具有半活体营养型生活方式。
3.4 草莓中未观察到 CAZyme、植物激素或 PR 基因的明显病害阶段特异性富集
研究人员在草莓中鉴定到 13,857 个病害阶段间的 DEGs，其中 763 个编码植物 CAZymes，157 个参与植物激素信号转导和生物合成，278 个为病程相关（PR）基因。草莓中这三类基因均未表现出明显的病害阶段特异性富集，但所有三类基因在中期-晚期侵染阶段上调表达的比例最高。乙烯（ET）相关基因在早期侵染阶段高度富集（p < 0.01），而茉莉酸（JA）相关基因在中期-晚期侵染阶段富集（p < 0.01）。在中期至晚期的坏死营养阶段，JA 相关基因的表达量在四类植物激素中最高。
3.5 高温上调并加速菜豆壳球孢致病性相关基因表达，同时抑制植物防御相关基因
在 3,516 个病害阶段×温度 DEGs 中，133 个基因在高温下于特定病害阶段上调表达，其中超过 77% 在中期侵染阶段表现出更大的诱导程度。层级聚类分析揭示了两种类型的高温相关基因：一类是在同一病害阶段内 30°C 相对 23°C 差异上调的基因，包括 CAZymes、效应蛋白（如 cerato-platanin）、次级代谢物相关基因以及转运蛋白（寡肽转运蛋白、ABC 转运蛋白、MFS 转运蛋白）和细胞色素 P450s；另一类是提前诱导表达的基因（占高温 DEGs 的 60%），例如三个中期特异性 MFS 转运蛋白在早期阶段即被 30°C 上调表达，多个晚期特异性基因（其中一半以上编码 CAZymes、效应蛋白和次级代谢物）在高温处理的中期即已上调表达。在草莓中鉴定到 222 个温度调控 DEGs，其中大多数属于高温抑制的推定免疫相关基因，包括富含亮氨酸重复序列蛋白激酶、PR-10 基因等；另有 42 个在 30°C 高度上调的基因主要是植物胁迫响应基因和可能的感病相关基因，如糖转运蛋白和乙烯形成酶。
五、讨论与结论总结
讨论部分，研究人员指出本研究支持菜豆壳球孢在草莓侵染期间具有半活体营养型生活史的假说。早期无症状阶段对应活体营养阶段，效应蛋白基因富集表达，与已报道的半活体营养型真菌（如炭疽菌属）的活体营养阶段特征一致；中期和晚期出现可见坏死，微菌核密度增加，次级代谢物基因先富集表达，随后 CAZymes 达到表达峰值，表明病原菌已转换为坏死营养阶段。草莓方面，尽管未观察到明显的阶段特异性基因富集，但乙烯信号在早期富集而茉莉酸信号在中期-晚期富集，与病原菌坏死营养阶段相符。高温加速病害的机制包括：菜豆壳球孢致病性相关基因上调或提前表达，同时草莓免疫相关基因被抑制，某些可能的感病因子（糖转运蛋白、乙烯形成酶）被诱导。研究结论部分可翻译为：该研究全面检验了高温对菜豆壳球孢完整侵染周期中病害进程和转录变化的影响。高温显著加速了病害进程。由于早期侵染缺乏坏死且表达关键活体营养相关基因，研究结果支持将菜豆壳球孢表征为半活体营养型真菌。同时，病原菌的坏死营养阶段与微菌核密度增加、根和冠部坏死以及次级代谢物和 CAZyme 编码基因的上调相对应。所用感病草莓品种的转录变化揭示了与病原菌亲和互作中的分子事件。未来需要比较抗病和感病草莓品种、或进行基因敲除和互补实验来确认菜豆壳球孢的感病因子。此外，该研究提出了高温下草莓 Macrophomina 侵染症状更严重和病程加速的可能机制：高温处理下菜豆壳球孢致病性相关基因提前诱导，推定植物感病因子上调表达，草莓防御相关基因下调表达。据研究人员所知，该研究是首次对菜豆壳球孢-草莓互作的分子表征，所提供的见解可推广至菜豆壳球孢寄主范围内的其他作物，特别是在气候变暖背景下种植的冷凉气候作物。研究中鉴定的可能感病基因可作为通过抗病育种或生物技术减轻高温毁灭性影响的靶标。
