《Biotechnology and Bioengineering》：Unmasking Glycoforms: Lectin-Based Profiling and Functional Implications of Targeted Glycosylation Knockouts in Chinese Hamster Ovary Cells
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单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）的糖基化是细胞株开发过程中难以合理设计并快速评估的关键质量属性。本研究探讨了在CHO细胞中进行靶向糖基因工程改造后，细胞表面糖基化能否作为mAb产物糖基化的替代读数。研究人员在两个生产mAb的CHO
单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）的糖基化是细胞株开发过程中难以合理设计并快速评估的关键质量属性。本研究探讨了在CHO细胞中进行靶向糖基因工程改造后，细胞表面糖基化能否作为mAb产物糖基化的替代读数。研究人员在两个生产mAb的CHO细胞系中对五个关键糖基因（COSMC、FUT8、β4GALT1、ST3GAL4和ST6GAL1）进行了研究。产物聚糖分析揭示了跨宿主一致的、基因特异性效应，包括核心岩藻糖基化的缺失，以及可调控的半乳糖基化和唾液酸化。基于凝集素的表面谱型分析可靠地反映了COSMC和FUT8修饰的产物结果，但与产物半乳糖基化和α2,3-唾液酸化表型的对应性有限，凸显了糖基化通路的冗余性和上下文依赖性。这些发现表明，基于凝集素的谱型分析在识别与非冗余通路相关的糖工程结果方面最为有效，而非作为产物糖基化的通用预测指标。
**论文解读：基于凝集素的表面谱型分析在CHO细胞靶向糖基化工程中的应用与局限性**
**一、研究背景与目的**
治疗性单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）构成生物制药中最大且增长最快的类别，其临床疗效、药代动力学和安全性特征与Fc和Fab结构域的糖基化密切相关。核心岩藻糖基化、半乳糖基化和唾液酸化的变异可深刻影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）、补体激活、血清半衰期和免疫原性。因此，糖基化被视为治疗性抗体的关键质量属性，大量的工程努力集中于改造宿主细胞系——最常用的是中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）细胞——以实现明确且可重现的聚糖谱。
尽管基因组编辑和通路工程取得了重大进展，糖工程CHO细胞株的开发仍然耗时且资源密集。一个持续的挑战在于快速识别和表征具有所需产物糖基化表型的工程克隆。直接分析分泌型抗体聚糖通常需要细胞扩增、蛋白纯化和专门的分析流程，在早期细胞株开发阶段造成瓶颈。因此，人们对于能够实现工程群体快速筛选和分选的上游或替代读数产生了浓厚兴趣。细胞表面糖基化反映分泌系统内糖基化通路的活性，可使用凝集素快速检测，是一种有前景的替代方法。然而，细胞表面聚糖表型能否可靠地反映分泌型mAb糖基化，在很大程度上仍未明确，且高度依赖于环境。为此，本研究系统考察了五个与抗体糖基化相关且原则上可通过细胞表面凝集素检测的糖基因：COSMC、FUT8、β4GALT1、ST3GAL4和ST6GAL1，涵盖O-聚糖延伸以及N-连接核心岩藻糖基化、半乳糖基化和唾液酸化的关键步骤，同时包含功能缺失和功能获得两种扰动类型。为评估所观察表型的稳健性，研究人员将上述修饰分别导入两个产生不同mAb的CHO细胞系——CHO VRC01和NISTCHO中。二者产生的抗体在糖基化位点上存在差异：NISTmAb仅含两个Fc区N-糖基化位点，而VRC01同时含有Fc和Fab N-糖基化位点（各两个）。通过将产物聚糖分析与凝集素辅助流式细胞术和共聚焦显微镜相结合，本研究旨在明确细胞表面糖基化谱型分析作为糖工程细胞株表征工具的效力与局限。
**二、主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：（1）利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除（pX458载体）分别靶向Fut8、β4GalT1、COSMC和ST3Gal4基因，并通过ST6Gal1过表达质粒（puno1-hst6gal1a，Invivogen）实现功能获得改造；（2）通过电穿孔（Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V，Lonza Bioscience）将质粒导入两种mAb生产CHO细胞系——CHO VRC01（ActiPro培养基，HyClone）和NISTCHO（EX-CELL CD-CHO Fusion Medium，SAFC），经凝集素辅助流式细胞分选或有限稀释克隆分离后以缺失PCR验证；（3）采用完整天然质谱法（Vanquish Flex UHPLC联用Thermo Scientific Exploris MX质谱仪，BioPharma Finder软件去卷积）对纯化的mAb产物进行聚糖分析；(4)使用植物源凝集素和重组原核凝集素对培养第3天的细胞进行流式细胞术和共聚焦显微镜分析，以表征细胞表面糖基化；凝集素染色数据以染色指数（staining index, SI）和平均荧光强度（mean fluorescence intensity, MFI）量化。
**三、研究结果**
**3.1 糖基因工程CHO细胞系的生成**
研究人员将五个糖基因（COSMC、FUT8、β4GALT1、ST3GAL4和ST6GAL1）的靶向扰动导入两种mAb生产CHO细胞系（CHO VRC01和NISTCHO），包括基因敲除（COSMC、FUT8、β4GALT1、ST3GAL4）和过表达策略（ST6GAL1）。经克隆细胞系建立并通过缺失PCR验证后，收获抗体产物进行聚糖分析。
**3.2 靶向糖基因工程后的产物糖基化结果**
产物聚糖分析揭示了在两种CHO背景下均一致的、基因特异性效应。FUT8敲除导致mAb聚糖核心岩藻糖基化的完全消除，同时总体聚糖复杂性（天线数、半乳糖基化、唾液酸化）基本保留。β4GALT1敲除导致mAb半乳糖基化近完全丧失；ST3GAL4敲除消除了可检测的α2,3-唾液酸化物种而不影响总体聚糖占用率；ST6GAL1过表达则引入了在野生型CHO来源抗体中基本不存在的显著α2,6-唾液酸化。值得注意的是，NISTCHO细胞中ST6GAL1过表达仅产生约6%–7%的适度增加，原因是NISTmAb天然唾液酸化水平有限。此外，由于VRC01含Fab糖基化位点，其产物糖基化指数反映Fc和Fab位点的复合贡献，这解释了VRC01工程细胞系中残存唾液酸化的现象。ST3GAL4敲除在两种背景下均未产生预期的前体半乳糖基化聚糖的普遍积累，反而在VRC01背景下伴随G0F物种显著增加和半乳糖基化指数下降，提示ST3GAL4扰动可能通过影响高尔基体中邻近糖基转移酶的组织或活性而降低半乳糖基化效率。ST6GAL1过表达仅引起总体聚糖分布的适度改变，但确认了α2,6-唾液酸化通路的成功导入。
**3.3 基于凝集素分析的细胞表面糖基化谱型分析**
凝集素辅助流式细胞术显示，对于表现出二元功能行为的糖基因，细胞表面聚糖丰度与产物表型之间存在强一致性。FUT8敲除细胞中岩藻糖特异性凝集素结合显著减少，COSMC敲除细胞中Vicia villosa凝集素（VVL）结合显著增加，且这些效应在CHO VRC01和NISTCHO背景下均一致。共聚焦显微镜定性支持流式细胞术的发现，但在某些条件下（如NISTCHO背景下MAL1染色和COSMC敲除的VVL染色），亲本与工程细胞系之间的差异程度不如流式细胞术显著。
**3.4 β4GALT1和ST3GAL4的表面与产物糖基化解偶联**
与FUT8和COSMC相反，β4GALT1和ST3GAL4的扰动尽管对抗体糖基化有显著影响，却未产生清晰可辨的细胞表面糖基化表型。凝集素辅助流式细胞术和共聚焦成像均无法可靠地区分β4GALT1敲除或过表达克隆与亲本对照；ST3GAL4敲除细胞在膜表面保留可检测的α2,3-唾液酸化，尽管其产生的抗体缺乏α2,3-唾液酸化聚糖。即使某些凝集素染色指数达到统计学显著，流式细胞术直方图显示工程群体与亲本群体之间缺乏明确分离，限制了基于荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）的直接区分和富集效用。
**3.5 植物源凝集素与重组凝集素的比较**
植物源凝集素和重组原核凝集素（recombinant prokaryotic lectins, RPLs）在CHO VRC01背景下均检测到预期趋势，但RPL染色表现出更大的变异性和更宽的荧光分布，尤其在NISTCHO细胞中。预偶联的植物源凝集素提供了更可重复和可解释的整体表面聚糖丰度测量，而共聚焦成像提供关于聚糖分布而非绝对表面负载的互补空间信息。重组凝集素可能更适合活性细胞应用。
**四、讨论与结论**
本研究表明，CHO糖工程中一个核心挑战在于：强烈改变产物糖基化的基因修饰不一定在细胞表面产生成比例或易于分辨的变化。表面与产物糖基化之间的对应程度高度依赖于靶酶、通路架构和宿主细胞背景。编辑具有有限冗余度的酶（如COSMC和FUT8）能产生清晰且一致的表面表型，与产物糖基化高度吻合；而涉及高度冗余通路（如β4GALT1和ST3GAL4）的扰动则在显著改变抗体糖基化的同时使表面糖组基本保持完整。这种冗余源于CHO细胞中存在多个β4GALT和ST3GAL同工酶，且β4GALT1可能对Fc聚糖加工具有优先活性，而其他同工酶继续支持内源细胞表面糖蛋白的糖基化。此外，ST3GAL4敲除后聚糖物种的重新分布可能反映高尔基体糖基化机制高阶组织的变化，包括糖基转移酶同源和异源复合物的形成以及相邻酶活性、定位或稳定性的相互影响。产物微异质性（如VRC01同时含有Fc和Fab糖基化位点）和宿主细胞基线差异也影响结果解读。流式细胞术和共聚焦显微镜分别报告聚糖呈现的不同方面：前者整合整个质膜的荧光提供群体平均的总表面凝集素结合信号，后者检测空间组织和可及的聚糖微结构域。植物源凝集素与重组凝集素的比较表明，前者在固定细胞成像中更可靠，后者可能更适合活性细胞应用。总之，凝集素表面谱型分析是CHO糖工程工作流程中的有价值组分，但其可解释性固有地依赖于背景——细胞表面糖基化不应被用作产物糖基化的通用替代指标。凝集素分析在结合酶冗余性、宿主细胞背景和预期修饰性质等先验知识的前提下最为有效，尤其在早期群体筛选或微群体富集中，可作为一种快速、低复杂度的分选工具，缩短开发周期。
