甲硫氨酸γ-裂解酶通过特异性丝氨酸介导的亲和力捕获辅因子吡哆醛-5′-磷酸

《Journal of Advanced Research》：Methionine γ-lyase traps cofactor pyridoxal-5′-phosphate through specific serine-mediated affinity

　　

吡哆醛-5′-磷酸（PLP）是一种普遍且古老的关键辅因子，在酶催化的消除反应、转氨反应及其他反应中发挥重要作用。PLP依赖性酶的催化效率显著高于游离PLP。酶对溶液中PLP的招募，尤其是通过活性位点入口以外的相互作用进行的招募，是决定PLP介导催化反应发生的关键步骤。然而，酶招募溶液中PLP的精确机制仍不清楚。本研究旨在阐明酶（特别是通过耗尽血清或膳食甲硫氨酸抑制癌细胞增殖的甲硫氨酸γ-裂解酶（MGL））招募溶液中PLP的机制，并研究C端结构域在此过程中的作用。研究还旨在探索PLP招募与宿主生物体内高效L-甲硫氨酸分解代谢之间的关系。研究人员解析了yMGL的晶体结构，该酶属于新鉴定的胱硫醚γ-裂解酶亚群，与L-甲硫氨酸和PLP形成复合物。为研究C端结构域在PLP招募和酶活性中的功能作用，研究人员进行了C端结构域截短和突变，并在体外和体内评估了其效应，分别分析了PLP结合亲和力和L-甲硫氨酸分解代谢的变化。通过结构、生化、生物信息学和代谢分析，研究人员证明yMGL的C端结构域（位于典型PLP结合结构域之外）对于yMGL与PLP的特异性相互作用以及L-甲硫氨酸分解代谢至关重要。该结构域内一个保守的丝氨酸残基位于活性位点入口之外，决定了PLP的招募。这些发现阐明了一种此前未被表征的MGLs招募PLP的机制，并为合理设计具有增强PLP结合能力和催化性能的MGLs提供了依据。

**基于结构解析的MGL辅因子PLP招募机制研究解读**

**一、研究背景与科学问题**

吡哆醛-5′-磷酸（pyridoxal-5′-phosphate, PLP）是维生素B6的活性形式，作为广泛存在且功能多样的辅因子，参与氨基酸代谢、抗生素生物合成以及多种关键神经递质的生成。PLP依赖性酶催化消除、转氨、脱羧、外消旋、取代及逆羟醛缩合等反应，约占所有酶活性的4%。在进化上，PLP依赖性酶促反应比相应非酶促PLP反应快约10⁷–10⁹倍。酶的催化活性受三个步骤控制：从环境中招募PLP、PLP在活性位点的结合以及随后在催化中心进行的PLP介导的催化反应。其中，环境PLP的招募是决定PLP进入活性位点的重要步骤。尽管有研究推测保守的C端环状基序可能为PLP依赖性酶之间的直接PLP转移提供界面，但酶如何从溶液中招募游离PLP的机制仍不清楚。

甲硫氨酸γ-裂解酶（methionine γ-lyase, MGL）是一种典型的PLP依赖性酶，催化L-甲硫氨酸（L-methionine, L-Met）的γ-消除反应，生成α-酮丁酸、甲硫醇和氨。MGLs属于胱硫醚γ-裂解酶家族，通过消耗生物系统中的L-Met来抑制癌症进展并促进健康寿命，具有重要的治疗意义。然而，尽管PLP在整个甲硫氨酸裂解反应中不可或缺，MGLs在催化前如何招募游离PLP的机制仍是空白。本研究以具有强L-Met降解能力的解脂耶氏酵母（*Yarrowia lipolytica*）来源的MGL（yMGL）为对象，旨在阐明MGL招募PLP的精确分子机制。

**二、研究内容与总体结论**

研究人员解析了yMGL与底物L-Met和辅因子PLP的复合物晶体结构（PDB ID: 9UUW），结合体外生化分析、体内遗传学实验、生物信息学分析及代谢组学检测，揭示了yMGL招募PLP的全新机制。研究表明，位于经典PLP结合结构域之外的C端结构域对于yMGL与PLP的特异性结合以及L-Met的分解代谢至关重要。该结构域中一个高度保守的丝氨酸残基（S333）位于活性位点入口之外，是决定PLP招募的关键氨基酸。通过该丝氨酸介导的“PLP捕获模块”，MGLs能够高效地从溶液中特异性地招募PLP。该发现为理解PLP依赖性酶的分子进化提供了新视角，并为通过蛋白质工程改造酶以增强其PLP结合能力及催化性能奠定了理论基础。该研究成果发表于《Journal of Advanced Research》。

**三、主要关键技术方法**

该研究综合运用了多种关键技术手段。首先，通过X射线晶体学技术解析了yMGL与L-Met和PLP的复合物高分辨率晶体结构。其次，采用位点-directed突变（包括丙氨酸扫描、C端截短和点突变）结合表面等离子体共振（SPR）和热稳定性位移分析（TSA）测定PLP结合亲和力。再次，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了yMGL C端结构域缺失的解脂耶氏酵母菌株（以W29为遗传背景），并采用超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）检测α-酮丁酸代谢物水平。此外，还运用AlphaFold3进行蛋白质结构建模和分子对接模拟，并通过祖先序列重建（ancestral sequence reconstruction, ASR）进行进化分析。定点突变和酶动力学测定用于评估酶活性，圆二色光谱（CD）和动态光散射（DLS）用于表征蛋白质构象和寡聚状态。

**四、研究结果**

**（一）yMGL-L-Met-PLP复合物的结构**

yMGL属于新鉴定的胱硫醚γ-裂解酶亚群，在系统发育上区别于其他已表征的家族成员。其晶体结构显示，yMGL形成二聚体架构，活性位点位于相邻单体界面处。每个单体包含N端结构域（残基7–63）、PLP结合结构域（残基64–261）和C端结构域（残基262–379）。在活性位点，PLP与K204的ε-氨基共价形成希夫碱，磷酸基团与G91和T203形成氢键，L-Met的羧酸基团与R344和R357形成盐桥，氨基与T332形成氢键。通过丙氨酸扫描诱变结合L-Met降解实验，鉴定出22个对yMGL活性至关重要的关键氨基酸残基，其中21个位于N端和PLP结合结构域，仅S333位于C端结构域，这提示C端结构域可能具有未被表征的特殊功能。与嗜热酶hMGL和pMGL相比，yMGL在活性位点lid区域含有一个延伸环，该环的B因子值较高，可能与其低温适应性相关。

**（二）C端截短对结构和功能的影响**

通过构建C端截短变体yMGL-ΔCTD（缺失残基253–380），研究发现C端截短导致yMGL的四级结构从同源四聚体转变为同源六聚体，并引起圆二色光谱变化，表明二级结构组成发生改变。在最佳反应温度下，yMGL-ΔCTD的L-Met降解活性比全长yMGL高7.20倍，这与其增强的L-Met结合亲和力一致（Km从1.50 mM降至0.75 mM）。然而，yMGL-ΔCTD的热稳定性和动力学稳定性显著降低。关键的是，表面等离子体共振分析显示，全长yMGL对PLP的平衡解离常数（KD）为3.31×10^-5 M，分离的C端结构域（yMGL-CTD）的KD为1.03×10^-5 M，而yMGL-ΔCTD对PLP无可检测的结合亲和力。这表明C端结构域是yMGL结合PLP所必需的。体内实验显示，在补充PLP的培养基中，敲除C端结构域的菌株胞内外α-酮丁酸积累水平显著增加，表明尽管yMGL-ΔCTD转录水平下降，但其在胞内充足PLP条件下表现出更高的裂解酶活性。

**（三）C端结构域中决定PLP特异性作用的关键氨基酸残基**

在yMGL的同源四聚体结构中，C端结构域延伸至活性位点上方并覆盖入口。结构预测表明R255、K270和S333可能参与PLP相互作用，但突变实验证实仅S333A突变导致PLP结合亲和力降低27.54倍，且热稳定性位移（ΔTm）下降3.4°C。在人类MGL（hMGL）中，高度保守的对应残基S340A突变同样显著降低了PLP结合亲和力（ΔTm下降7.6°C）。因此，位于活性位点入口附近的保守丝氨酸残基是决定MGLs特异招募PLP的关键。AlphaFold3建模显示，在yMGL-ΔCTD中活性位点变得表面暴露，PLP更容易进入活性位点，这解释了截短变体活性升高的现象。

**（四）祖先序列重建揭示保守丝氨酸的进化意义**

通过祖先序列重建策略，研究人员从yMGL亚家族的系统发育树中推断出十个假定祖先节点。序列分析和单体结构比对显示，yMGL、其重建祖先以及其他MGLs的C端结构域中，丝氨酸残基周围均存在环状区域，提示该“PLP捕获模块”在进化上是保守的。此外，yMGL表现出胱硫醚γ-合酶活性，并在系统发育上与胱硫醚γ-合酶聚类，表明yMGL保留了祖先的广泛底物混杂性和PLP捕获模块，这反映了PLP依赖性酶在辅因子驱动下的分子进化特征。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，yMGL在活性位点中T332、R344和R357通过与多种底物形成氢键和盐桥而贡献其底物混杂性，而A118不直接参与底物相互作用。C端结构域的截短导致四聚体向六聚体的转变，可能与yMGL更高的环含量和结构柔性有关，并影响二聚体间的界面相互作用。研究提出，在早期地球条件下，氨基酸作为PLP依赖性酶的典型底物，可能通过非酶促PLP反应进行转化，而PLP的捕获是代谢进化中限速且关键的一步。本研究中鉴定的保守丝氨酸残基位于活性位点入口外的延伸环中，连同其周围环区构成“PLP捕获模块”，促进MGLs对PLP的特异性招募。该环状区域的适应性使它们成为蛋白质工程的可行改造靶点。

**结论翻译**：yMGL代表了胱硫醚γ-裂解酶家族中一个新鉴定的亚群。本研究报道了其晶体结构（PDB ID: 9UUW），并表明位于典型PLP结合结构域之外的C端结构域决定了PLP的特异性亲和力，是L-Met降解所必需的。该C端结构域中的一个丝氨酸残基在yMGL、其重建祖先同源物及其他MGLs中高度保守，并且在yMGL和hMGL中介导丝氨酸-PLP相互作用。研究推断MGLs已进化出一种PLP捕获机制，其中保守的丝氨酸在活性位点入口附近的结构基序处促进选择性PLP招募。这些发现增进了对酶识别和招募PLP机制的理解，为PLP依赖性酶的分子进化提供了机制框架，并为改造具有增强或改变PLP特异性的酶奠定了合理基础。