3D打印光子屏蔽组件用于小鼠双光子成像低噪声视觉刺激期间的防护

《Advanced Materials Technologies》：3D Printed Photon Shield Assembly for Low-Noise Visual Stimulation During Two-Photon Imaging in Mice

　　

在动物实验中，双光子钙成像（two-photon calcium imaging）为研究神经元群体活动提供了有力手段，但其与视觉刺激联用会带来固有技术挑战：刺激用光可进入探测光路，导致杂散光（stray-light）污染并损害信号质量。为解决该问题，研究人员开发了Photon Shield，一种开放硬件遮光系统，由3D打印头板与导轨安装的包绕物镜的圆柱形屏蔽组成。研究人员旨在创建一种制造可及、跨实验室可重复、安装简单且在最小化刺激相关伪影上有效的方案。定量测量显示，相对于传统方法，该系统将污染光子通量降低两个数量级，从而即使在高强度视觉刺激下也维持荧光信号完整性。在Thy1-GCaMP6s小鼠中的功能验证确认了视觉皮层中方向选择性反应的可靠检测，同时表明头固定的机械稳定性足以支持清醒头固定记录。更广泛地，Photon Shield展示了增材制造如何为实验工具开发引入质的新范式：3D设计实现对常被忽视的实验配件进行数字化规范，允许本地制造、改进并跨实验室重新共享，将定制方案转化为演进生态系统中的元素。

研究背景方面，双光子钙成像联用视觉刺激时，显示器或投影仪发出的刺激光经散射进入以光电倍增管（PMT）探测的近红外飞秒激光诱导荧光光路，造成杂散光污染。现有策略如按扫描行频同步液晶背光、光谱分离刺激光与绿光探测带、近眼圆锥遮光罩或VR微显示屏、以及临时粘贴绝缘胶带，均存在需定制电子、波长偏倚、视野受限、对齐困难或不可复现等缺陷。既往3D打印遮光件又多绑定特殊大口径mesoscope而不具通用性。因此亟需一种高效、简便、可本地制造且跨实验室可重复的光屏蔽方案。研究人员据此开展本研究，论文发表于《Advanced Materials Technologies》，核心结论是：所开发的Photon Shield可将泄漏光子通量降至脑源荧光信号以下约两个数量级，在10×、16×、20×多种水浸物镜上均有效，且SLA（立体光刻）打印树脂头板的清醒固定稳定性与不锈钢头板无统计学差异，从而兼顾低噪声视觉响应检测与开放硬件可演进性。

主要关键技术方法上，研究人员基于SolidWorks构建小鼠头部、开颅窗、持头杆与物镜运动范围的三维几何模型，采用Formlabs Form3B+以BioMed Black v1树脂行SLA打印，头板边缘设导轨接口、屏蔽为两片圆柱加“sombrero”顶环。光通量定标方面，以低光强下平均图像强度与探测光子数线性比校准PMT（光电倍增管），在OLED/LCD监测屏1.8、6.5、37 cd/m²三种光强下开关激光与显示器，分离signal、dark noise与monitor crosstalk并扣除本底。功能验证使用Thy1-GCaMP6s转基因小鼠（C57BL/6J背景，慢性植入3D打印头板，4 mm开颅覆玻璃盖片），以FMM（fentanyl-midazolam-medetomidine）麻醉或清醒固定，920 nm飞秒激光共振扫描，PsychoPy呈现8向漂移光栅，CaImAn做CNMF（约束非负矩阵分解）源提取。机械稳定性则同步用近红外相机录体动，以CaImAn刚体校正获皮质位移峰值。

研究结果部分，2.1节设计显示Photon Shield由头板、两片圆柱屏蔽、sombrero顶环三部分组成，SLA哑光黑生物相容树脂打印，导轨接口使含耦合水凝胶（immersion gel）全程安装<90 s，兼作水浸物镜与开颅窗间耦合容器。2.2节屏蔽效率定量表明，无屏蔽时刺激光远超脑荧光（约2.5·10⁶ s^?1光子），绝缘胶带在强光下仍超信号，弱光下占绿/红通道21%/11%；Photon Shield下泄漏仅占典型荧光0.14%（1.8 cd/m²）、0.70%（6.5 cd/m²）、5.8%（37 cd/m²），屏蔽比约1.5·10^?4，较胶带降两个数量级；去sombrero增漏13%/11%，加面部遮光帽仅再降7%/21%，说明主要漏光非经眼入路。10×/16×/20×三物镜绿通道屏蔽比分别约1.5·10^?4、1.5·10^?4、1.4·10^?4，绝对漏光随前透镜直径减小而降。2.3节在V1 Layer 2/3成像显示，胶带屏蔽下全视场均值在刺激 onset 陡升且随光栅方向波动，20%–80%上升时间125±85 ms；Photon Shield下均值下降、上升时间延至529±111 ms，符合GCaMP6s生理动力学，CaImAn自动检出381个细胞中具方向选择性指数（OSI）与方向选择性指数（DSI）分布，13只小鼠117次记录（含5次清醒）证实可靠。2.4节机械稳定性中，不锈钢头板清醒皮质最大位移1.21±0.58 μm，3D打印头板1.58±0.24 μm（p=0.30），重量0.53 g略高于钢版0.48 g但夹持凸台加大补偿刚度，满足清醒成像。

讨论与结论翻译：本研究开发并验证了一种3D打印遮光系统，可在小鼠体内双光子钙成像联用视觉刺激时有效阻断散射光。该方案将精心设计的头板与导轨安装、包绕物镜的对准屏蔽结合，显著降低刺激相关光污染，从而改善视觉诱发神经元反应的检测与分析。所述解法是直接可实施维护的，无需复杂电子或光学，能以极小额外时间融入既有流程；所有零件可本地打印，便于耗材补充或针对其他物镜/硬件定制，并可扩展至大鼠、绒猴、猫及宽场荧光或内源信号成像。清醒会话中快速可重复安装减少操作时间与动物应激。尽管当前树脂已提供充足光隔离（主要受限于经眼不可免泄漏），未来可用替代材料进一步抑红通道串扰。更广义地，Photon Shield说明增材制造为神经科学实验工具开发引入质的新范式：3D设计与增材制造实现对常忽视配件的精确数字规范与复制，设计可迭代细化并跨实验室共享，使定制配件从孤立隐性构造转为开放演进生态的元素。该系统中，Photon Shield既是实用的低杂散光的双光子遮光解，也是开放可制造设计加速实验标准化、降低采购壁垒与促进跨实验室采纳的范例。