《Journal of Chromatography A》：Effect of Pore Size on Plate Height for 23-mer Oligonucleotides Separated Using Fully Porous Particles and Ion-Pairing Reversed-Phase Liquid Chromatography
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•实验测定了一个23个核苷酸寡核苷酸的板高。•研究了具有不同颗粒和孔径的几种不同柱子。•观察到当孔径大于200 ?时，性能有显著提升。•板高的差异会转化为梯度洗脱条件。引言在快速发展的治疗环境中，持续提高分析能力对于确保基于RNA的药物的安全性和有效性至关重要。识别和量化药物中的
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实验测定了一个23个核苷酸寡核苷酸的板高。
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研究了具有不同颗粒和孔径的几种不同柱子。
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观察到当孔径大于200 ?时，性能有显著提升。
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板高的差异会转化为梯度洗脱条件。
引言
在快速发展的治疗环境中，持续提高分析能力对于确保基于RNA的药物的安全性和有效性至关重要。识别和量化药物中的杂质是治疗性寡核苷酸（ONs）控制策略的重要组成部分，这些寡核苷酸包括小干扰RNA（siRNA）、反义寡核苷酸（ASOs）、单导向RNA（sgRNA）和信使RNA（mRNA）[1]。离子对反相液相色谱法是分离ONs的金标准；然而，由于这些分子的复杂性以及许多杂质的结构相似性，完全分辨杂质和相关物质仍然是一个挑战[2]。需要创新的色谱方法来更好地理解并进一步提高ONs的分离效果。
与小分子的分离一样，色谱的选择性和效率是色谱分辨率的重要驱动因素。色谱效率受固定相颗粒大小（及其对涡流分散的影响）、分析物在颗粒间和通过颗粒的传递以及分析物的扩散性的影响。开发可用于量化这些效应的详细理论促进了分离优化的框架的发展，例如动力学图[3][4][5][6][7]。动力学图框架使分析师能够轻松评估在给定的分析时间预算下，哪种条件组合（即颗粒大小、柱子尺寸和流速）最有可能产生最佳结果[8]。动力学图已成功用于小分子混合物的分析方法优化。然而，这只有在过去几十年通过对板高与固定相颗粒大小、分析物扩散性、柱子尺寸和流速依赖性的仔细测量后才成为可能。不幸的是，目前色谱文献中关于ONs的类似信息非常少。
其他研究小组的工作已经开始探讨ONs的分离动力学方面，但我们认为目前仍存在许多重要的知识空白。例如，尽管有证据表明孔径大于通常用于小分子分离的孔径（80-120 ?）的固定相可能更有益（例如，参见参考文献[2]的第12页，显示选择性随着孔径增加到300 ?而提高），但许多现代出版物仍专注于使用小孔固定相进行ONs的分离。自2016年以来，人们已经知道通过将孔径从80 ?增加到150 ?可以将ONs的分辨率提高20倍[9]，然而自2020年以来的几篇论文仍然使用小孔固定相[10][11][12][13][14][15][16][17][18][19]。1993年，Huber等人使用直径约为2 μm的非多孔聚苯乙烯二乙烯基苯（PS-DVB）颗粒在IPRP条件下展示了ONs的分离[20]。后来，在2013年，Yamauchi等人展示了孔径高达4,000 ?的多孔PS-DVB颗粒在ONs分离中的效用[21]。就在今年，Maurer等人使用了大孔PS-DVB柱子，并将具有不同孔径的柱子结合在一起，用于一次性分析从单个碱基到6,000个碱基的ONs的IPRP分离[22]。此外，Guillarme、Goyon及其同事发表了几篇关于使用大孔材料（范围数千埃）进行大寡核苷酸盐及相关物质尺寸排阻分离的论文[23][24][25]。在所有这些案例中，虽然展示了几张看起来很好的色谱图，但几乎没有提供动力学或板高数据。在最近的一个例子中，2019年Roussis等人筛选了数十种不同的柱子，这些柱子在化学性质、颗粒大小和供应商方面有所不同，目的是为了识别治疗性磷酸二酯ONs中杂质位置异构体的有希望的分离候选者[26]。同样，这篇论文描述了一个丰富的数据集，但完全没有讨论任何柱子的动力学性能差异，甚至没有提到使用的固定相的孔径。
在这项工作中，我们在等度IPRP条件下确定了替代23个核苷酸治疗性ON的板高。鉴于之前观察到板高与保留因子有很强的依赖性[27,28]，我们非常仔细地比较了在相似保留因子下不同材料的板高，这需要仔细调整流动相条件。我们研究了总共八种不同的全多孔固定相材料的行为，包括聚合物和基于硅的材料，孔径范围从80到4,000 ?，颗粒大小从1.8到5.0 μm。最后，我们评估了在等度板高数据中观察到的趋势与在溶剂梯度洗脱条件下固定相颗粒和孔径对ON分辨率影响的观察结果的一致性程度。
章节摘录
化学物质和试剂
超纯（18.2 MΩ）水是在Millipore（Burlington, MA）购买的Milli-Q Advantage A10水净化系统（Z00Q0V0T0）中制备的。乙腈（ACN；梯度HPLC级）、六氟异丙醇（HFIP）、二异丙基乙胺（DIPEA）、尿嘧啶、丁酰苯酮和胸苷一磷酸（dT1；水合物盐）是从Millipore-Sigma（St. Louis, MO）购买的。所有化学品均按接收状态使用。ONs（LR8、LR10、dT5、dT10、dT25、dT50和dT100）是从
使用聚合物颗粒时孔径效应的初步观察
在这项工作的早期阶段，我们非常关注板高与保留因子的依赖性，因为一些先前的观察表明在1 < k < 5的范围内，板高会有显著变化，这与溶剂梯度洗脱条件下的分离相关[27,28]。图1显示了我们称之为LR8的23个核苷酸替代治疗性ON的这种依赖性，该寡核苷酸的骨架中没有磷硫酯键，且使用的柱子是聚合物
讨论
最近，Mollen、Cabooter及其同事报告了在当代LC分离ONs相关的溶剂中，对于5到45个碱基范围的poly dTs的分子扩散系数（Dm）的实验测定结果[32]。他们展示了在含有离子对试剂（他们使用了三乙胺或己胺）的溶剂中，可以使用杨氏方程合理准确地估计Dm，其中T是温度，η是溶剂的粘度，MW是
结论
在这项工作中，我们测量了在离子对反相条件下，使用全多孔固定相材料的替代治疗性寡核苷酸（ON；23个核苷酸）的等度板高，并开始评估观察到的板高趋势在溶剂梯度洗脱条件下的适用程度。具体来说，我们研究了固定相颗粒内部孔径对板高与流动相速度依赖性的影响。
CRediT作者贡献声明
Daniel Meston：写作——审阅与编辑，写作——初稿，调查。Nolan Eckmann：写作——审阅与编辑，写作——初稿，可视化，调查，形式分析。Ronard Pabi：方法学，调查。Bob Pirok：写作——审阅与编辑，方法学。Matt Sorensen：写作——审阅与编辑，概念化。Todd Maloney：写作——审阅与编辑，资金获取，概念化。Dwight Stoll：写作——审阅与编辑，写作——原始
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢Agilent Technologies提供用于这项工作的PLRP-S和Extend C18柱子。所有实验都是使用Agilent提供的仪器进行的。RP得到了国家科学基金会（CHE2505978）的资助。
Daniel Meston|Nolan Eckmann|Ronard Pabi|Bob Pirok|Matt Sorensen|Todd Maloney|Dwight Stoll
