具有pH门控多孔染料负载陶瓷体的阴离子（如腺苷5?-三磷酸）荧光传感

《Small》：Fluorescence Sensing of Anions Like Adenosine 5?-Triphosphate With pH-Gated Porous Dye-Loaded Cerasomes

　　

摘要：开发能够按需控制孔隙开启的门控系统，是众多应用领域中控制化学功能的一种颇具吸引力的途径。本研究考察了将多种报告染料负载进入无孔和多孔陶瓷体（一种杂化纳米仿生材料）的过程，以及pH依赖性超分子腺苷5?-三磷酸（ATP）在锚定于陶瓷体孔道出口的多胺门控分子上的结合如何影响pH门控。这类有机-无机纳米囊泡由交联硅质脂质双层包封液体填充空腔构成。研究人员通过在合成过程中将泊洛沙姆嵌段共聚物插入膜中，成功制备了多孔陶瓷体。据研究人员所知，这是多孔陶瓷体的首次报道及其在门控应用中的使用实例。研究人员成功地将报告分子包封或负载进入这些物体中，负载偏好取决于其电荷、疏水性和化学结构。添加响应pH和/或阴离子（如ATP）的分子门可实现孔道的受控开启，从而调节质子内流，并可通过荧光响应读出。考虑到相应的pH敏感性，染料负载陶瓷体有望成为检测相关浓度（0.02至1000 μM）ATP的试剂，其荧光响应速度明显快于标准门控介孔材料。

论文解读：基于pH门控多孔染料负载陶瓷体的阴离子荧光传感研究

研究背景与意义：杂化材料因其能够结合有机和无机材料的化学特性而长期受到广泛关注。在众多材料与合成路线中，以二氧化硅为基础材料通过溶胶-凝胶法制备的杂化物应用最为成熟，但多数此类材料的结构主要由无机部分组成，有机部分仅作为牺牲模板或功能性涂层。为制备具有真正杂化骨架的材料，研究人员关注由两亲性分子构成的物质，其中有机与无机组分之间存在共价键。陶瓷体正是这样一类杂化囊泡，通过溶胶-凝胶过程与脂质有机三烷氧基硅烷的自组装相结合制备而成，形成具有硅质表面的双层囊泡。与传统的全有机脂质体相比，无机硅氧烷框架赋予陶瓷体显著的稳定性，尤其是抵抗表面活性剂的能力，并可通过硅烷衍生物进行表面修饰。此外，脂质体易聚集融合成更大囊泡，这给药物递送或体内传感等医学应用带来实际问题；而陶瓷体由于二氧化硅交联形成的刚性表面不会发生这种囊泡融合。因此，陶瓷体兼具脂质体的优异生物相容性和良好生物可降解性等优点，同时具有更好的稳定性和多样的表面修饰可能性。研究人员基于对门控小分子释放的研究基础，对多孔陶瓷体用于传感应用产生兴趣，并开发了具有多阴离子调节门控功能的柔性纳米分子杂化系统，该系统可通过pH和阴离子（如ATP）的存在进行控制。检测生理相关阴离子如核苷磷酸盐在生化分析和诊断中至关重要。ATP除为所有生物提供能量外，还参与多种生物过程，包括DNA复制、多种酶促过程以及激素和神经功能的辅因子作用。值得关注的是，ATP可用作不同环境中微生物载量的标记物。因此，基于信号放大机制的新型传感检测ATP痕量的能力对于敏感、快速检测微生物载量或污染具有重要意义。虽然已有HPLC和生物发光等技术可用于ATP检测，但其复杂性或较高检测限限制了其适用性。基于亚微米尺寸陶瓷体杂化材料的门控指示剂系统因其高灵敏度，可填补上述方法不适用或灵敏度不足的能力空白。与基于MCM-41或SBA-15型介孔二氧化硅纳米颗粒的门控材料相比，这些新型物体还具有良好的生物相容性和较低的沉降倾向。

研究内容与结论：研究人员对多种荧光染料进行了系统研究，包括中性、正电荷和负电荷的有机化合物以及小分子和大分子作为货物。研究首先改进了前体脂质的合成路线，通过三步反应以77%的总产率获得N-[N-(3-三乙氧基硅烷基)丙基琥珀酰胺]二鲸蜡胺。通过优化超声温度、功率和时间等参数，实现了无孔陶瓷体的可重复制备，其中55°C为最佳超声温度。通过动态光散射和扫描电子显微镜表征，合成的无孔陶瓷体具有约200-300 nm的直径和中空结构。在染料包封研究方面，研究人员将多种染料分别在纯水和含5%乙醇的混合溶剂中加入到脂质溶液中，通过吸收光谱、荧光光谱和流式细胞术进行分析。结果表明，FITC标记的葡聚糖聚合物（FITC4000和FITC70000）在无孔陶瓷体中负载效率最高，尤其是在W5E中FITC70000的包封效率超过60%；而小分子阳离子染料如SRB、R6G、RhB、SfrO、RBP的负载效率非常低；RhB在负载时表现出特殊的蓝移发射，可用于负载陶瓷体的识别和分离。研究人员通过在合成过程中插入泊洛沙姆嵌段共聚物（Pluronic P-123、F-127、F-68），并添加氧化铁纳米粒子和罗丹明6G作为辅助剂，成功制备了多孔陶瓷体。通过酸性处理去除泊洛沙姆后，SEM图像显示这些陶瓷体具有10至100 nm的随机孔道和空心结构。随后，研究人员将多胺N'-(3-三甲氧基硅烷基)丙基二乙烯三胺（N3）接枝到多孔陶瓷体表面，构建了pH响应性和阴离子敏感性的分子门控。通过优化缩合反应时间，发现3小时的反应时间可获得具有可逆开关功能的门控系统。在pH门控和阴离子传感研究中，负载FITC70000的门控多孔陶瓷体在孔隙打开时表现出27倍的荧光增强，响应时间小于10秒，远快于传统门控介孔材料（5分钟至数小时）。在ATP传感实验中，该系统在HEPES-NaOH缓冲液（10 mM，pH 7.3）中能够以0.02 μM的检测限和宽达1 mM的动态范围检测ATP，且响应时间快速。竞争实验表明虽然其他阴离子会产生部分干扰，但后续添加ATP仍能产生预期响应。在实际应用验证中，通过棉签擦拭污染表面的ATP检测实验证实了该系统在卫生监测中的实用性。

关键技术与方法：本研究涉及的主要关键技术包括：①溶胶-凝胶法制备陶瓷体前体及杂化囊泡自组装与硅氧烷网络交联；②利用泊洛沙姆嵌段共聚物作为牺牲模板在多孔陶瓷体膜中引入孔道，结合氧化铁纳米粒子和罗丹明6G加速膜形成动力学；③多胺硅烷N3通过缩合反应接枝至陶瓷体硅质表面构建pH/阴离子响应分子门；④多种光谱学表征手段包括动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）、Zeta电位、尺寸排阻色谱（SEC）、流式细胞术、紫外-可见吸收与荧光光谱等；⑤基于荧光响应的ATP定量检测方法及校准曲线构建，使用相对不确定度法确定检测限。

研究结果分述：
2.1 陶瓷体前体合成：通过三步有机合成路线成功制备脂质前体3，总产率77%，所有中间体和产物均经标准表征确认。
2.2 无孔陶瓷体的制备与表征：系统优化超声温度（55°C最佳）、功率（75 W）和时间（5 min）等关键参数，获得直径约200-300 nm的空心球形颗粒。Zeta电位测量和SEC结果表明成功形成了交联硅氧烷网络，纯化后PDI降低至0.20，平均流体力学直径为254 ± 19 nm。
2.3 无孔陶瓷体中的染料包封：系统研究了九种不同性质染料在纯水和W5E中的包封效率。FITC70000在W5E中包封效率最高（>60%），而大多数小分子染料负载效率低于0.3%。RhB因其独特的蓝移发射现象被用于陶瓷体负载状态的光谱学指示。
2.4 多孔陶瓷体的制备与表征：通过在膜中插入泊洛沙姆并在合成后经酸性处理去除，成功构建多孔结构，SEM证实孔径为10-100 nm。通过用罗丹明6G进行后负载验证并结合流式细胞术门控分析，证实了膜内存在功能性孔道。
2.5 pH门控与阴离子传感：在碱性条件下，N3门控多孔陶瓷体的孔隙开放可实现内部pH的快速平衡（<10秒），而FITC70000等大分子货物保留在囊泡内部。系统对ATP的检测具有0.02 μM的低检测限和0.02-1000 μM的宽动态范围，并在实际棉签拭子测试中成功检测到污染表面的ATP。

结论部分：本研究成功制备了与脂质体类似但由两层超薄二氧化硅单层稳定的纳米杂化材料——陶瓷体，并改进了前体脂质的合成方案。通过将泊洛沙姆策略从脂质体化学和介孔二氧化硅化学适配到陶瓷体体系，首次制备了具有多孔膜的多孔陶瓷体。通过系统的染料负载研究，发现负载FITC70000的多孔陶瓷体在pH控制的荧光变化方面性能最佳，响应时间远快于传统门控释放系统。这种逆门控机制的优势在于响应速度（<10秒），而非传统系统的货物释放（5分钟至数小时）。该系统成功用于ATP作为模型阴离子的检测，具有低检测限（0.02 μM）和宽动态范围（至1 mM），并通过棉签拭子测试在表面污染检测中验证了其实用价值。当前正在进行的研究包括筛选泊洛沙姆替代物以获得更均匀的可控孔径、测试替代分子门以实现生物测定，以及将此类系统集成到侧向流免疫测定或微流控装置等传感平台中。