MFN2 介导的内质网 - 线粒体通讯重塑通过增强线粒体自噬缓解赭曲霉毒素 A 诱导的肝细胞铁死亡

《Journal of Hazardous Materials》：MFN2-mediated remodelling of ER-mitochondria communication alleviates ochratoxin A-induced hepatocyte ferroptosis by enhancing mitophagy

　　

摘要
真菌毒素是普遍存在的环境污染物，广泛分布于生态系统和食物链中，对环境安全和公众健康构成持久威胁。赭曲霉毒素 A (OTA) 是一种分布广泛且化学性质稳定的真菌毒素，具有公认的肝毒性，然而 OTA 暴露与肝损伤之间的机制仍不明确。本研究调查了线粒体融合蛋白 2 (MFN2) 介导的内质网 - 线粒体通讯在 OTA 诱导的肝毒性中的作用，特别强调其对线粒体自噬和铁死亡的调节。使用 OTA 暴露的鸡模型和原代鸡胚胎肝细胞 (CEHs)，通过组织病理学、超微结构、分子和基于荧光的分析以及 MFN2 过表达进行了检查。我们的发现表明，OTA 引起了明显的肝脏损伤以及线粒体和内质网结构异常。这些变化伴随着 MFN2 表达减少、内质网 - 线粒体接触减弱、Ca2?稳态紊乱和内质网应激激活。OTA 暴露还抑制了线粒体自噬和线粒体自噬流，这破坏了铁稳态进而诱导铁死亡。重要的是，MFN2 过表达恢复了内质网 - 线粒体通讯和线粒体自噬活性，并显著减轻了铁死亡。综上所述，这些发现表明 MFN2 依赖的内质网 - 线粒体通讯破坏通过损害线粒体自噬促进了 OTA 诱导的铁死亡，并确定 MFN2 是减轻真菌毒素相关肝损伤的潜在靶点。

引言
真菌毒素被归类为持久性有机污染物，具有高的环境稳定性，经常出现在食品和饲料中，对生物系统构成严重挑战，并对人类健康造成相当大的风险[1]。其在农产品和食物链中的频繁出现已成为全球关注的问题，据估计全球 60-80% 的作物受到真菌毒素污染，这损害了食品和饲料安全，并导致巨大的经济损失[2]。在最普遍的真菌毒素中，赭曲霉毒素 A (OTA) 是一种主要由曲霉属和青霉属真菌产生的次级代谢产物，常见于谷物和饲料中的天然污染物[3]。由于其卓越化学稳定性和对环境降解的抗性，OTA 难以从食品和动物饲料中消除。因此，其在整个食物链中的持续存在仍然是食品安全和动物生产的重大关注点，长期暴露与对人类和动物健康的一系列不良影响有关。最近的监测研究表明，谷物基食品中 OTA 的出现率通常在 50% 到 60% 之间[4]。在一项针对黎巴嫩市场上谷物衍生产品的调查中，约 48% 的样本中检测出 OTA，其中约 30% 高于欧盟设定的最大限值[5]。此外，国际癌症研究机构 (IARC) 已将 OTA 归类为 2B 类致癌物，表明其被认为对人类具有潜在致癌性 [6]。越来越多的证据表明，OTA 表现出多种毒性效应，如肾毒性、神经毒性、肝毒性、免疫毒性和致癌性，细胞毒性的机制涉及凋亡、DNA 损伤和氧化应激[7], [8]。实验证据表明 OTA 诱导了明显的肾毒性，包括显著的组织病理学损伤和肾纤维化。尽管 OTA 肾毒性已被广泛研究，但其肝毒性的潜在机制仍未被完全理解，仍值得进一步研究，以更全面地了解与该持久性真菌毒素相关的环境健康风险。

铁死亡是一种非凋亡类型的细胞死亡，其特征是依赖铁的脂质过氧化[9]。铁死亡的过程表现为细胞内铁积累、活性氧 (ROS) 过度产生以及氧化还原稳态丧失，主要由 GPX4 失活导致[10]。形态学上，铁死亡通过独特的线粒体改变与凋亡区分开来，包括线粒体嵴减少或消失、外膜破坏以及线粒体膜密度增加[11]。此外，铁死亡与多种疾病的发生和进展密切相关，特别是肝脏疾病。大量证据表明，铁死亡已被牵涉到酒精性和非酒精性脂肪肝疾病中的肝细胞丢失，后者代表了常见的慢性肝病形式[12]。有证据积累表明，代谢途径和铁稳态的破坏通过驱动铁死亡促进肝病[13]。鉴于此，阐明铁死亡与 OTA 诱导的肝损伤之间的关系可能为肝毒性的预防和管理揭示新的机制视角。

线粒体，以其双层膜结构为特征，对于许多过程至关重要，包括 ATP 合成、钙调节、铁稳态和自噬 [14]。线粒体质量控制依赖于生物发生、动力学和线粒体自噬之间的平衡相互作用。自噬是一种保存良好的分解代谢机制，通过形成自噬体和自溶酶体来拆解细胞内成分[15]。自噬在管理重大生物过程中至关重要，特别是在介导细胞反应方面，从而在应激条件下提供必要的能量。线粒体自噬是指专门专注于降解受损或功能障碍线粒体的选择性自噬[16]。有效的线粒体自噬对于通过清除受损、老化或过度产生 ROS 的线粒体来维持线粒体完整性至关重要，从而保持细胞代谢稳态[17]。相反，有缺陷的线粒体自噬导致功能障碍线粒体的过度堆积，这可能诱导氧化应激、代谢紊乱和细胞死亡途径的激活[18]。新兴证据表明，线粒体自噬失调与多种肝病的进展密切相关[19]。然而，线粒体自噬在 OTA 诱导的肝毒性中的具体作用仍 largely 不清楚。

内质网 (ER) 是一种基本的细胞器，对于各种细胞功能不可或缺，如蛋白质的折叠和修饰、细胞平衡的维持以及 Ca2+ 信号的调节[20]。在正常情况下，内质网应激作为一种适应性机制，通过激活未折叠蛋白反应 (UPR) 来维持内质网稳态[21]。然而，持续或未解决的内质网应激会破坏内质网功能，并导致线粒体相关内质网膜 (MAMs) 的功能障碍。MAMs 是由内质网和线粒体之间的物理和功能相互作用形成的特殊区域，作为 Ca2?信号、氧化还原平衡、脂质代谢、自噬和细胞应激管理的关键中心[22]。因此，线粒体和内质网相互作用的完整性和动态调节是细胞命运的关键决定因素。MAMs 组成的紊乱和内质网 - 线粒体接触的异常增强已被牵涉到多种病理状况中[23]。值得注意的是，MAMs 动力学的持续改变扰乱了线粒体 Ca2?稳态，导致 ROS 生成增加和线粒体功能受损[24]。MAMs 越来越被认为在自噬中发挥着 vital 作用，大量比例的自噬相关蛋白质在 MAMs 中发现，在那里它们促进自噬体形成以及线粒体分裂。

线粒体融合蛋白 2 (MFN2) 是一种线粒体 GTPase，在线粒体动力学和内质网 - 线粒体通讯中发挥着重要作用[25]。此外，MFN2 有助于稳定相邻线粒体之间的相互作用，调节内质网形态，并加强两个细胞器之间的连接。通过调节这两个细胞器之间的物理结合，MFN2 维持了 MAMs 的结构，并实现了跨内质网 - 线粒体接触位的协调 Ca2?转移和代谢交换[26]。适当的 MFN2 活性对于维持平衡的内质网 - 线粒体耦合是必需的，而 MFN2 失调可以改变内质网 - 线粒体接触的程度和稳定性，并扰乱线粒体 Ca2?稳态[27]。MFN2 参与一系列细胞过程，特别是 MAMs 稳态、线粒体质量控制、细胞能量稳态和线粒体自噬[28]。MFN2 的下调已被证明会破坏线粒体动力学和内质网功能，从而导致 MAMs 的结构和功能破坏。此外，MFN2 表达的减少导致线粒体碎片化和功能障碍，并减少线粒体 - 内质网接触，从而触发内质网应激[26], [29]。新兴证据表明，MFN2 失调与铁死亡有关。先前的研究表明，伴随 MAMs 破坏的 MFN2 表达减少已被与异常线粒体 Ca2?处理、增强的铁蛋白自噬、Fe2?积累和受损的 GPX4 依赖的抗氧化能力联系起来 [30]。此外，MFN2 的丧失也与 ACSL4 增加和 GPX4 表达减少有关，而 MFN2 活性的恢复减轻了与铁死亡相关的改变[31]。MFN2 越来越被认为是肝脏稳态和代谢适应的关键调节因子。肝脏 MFN2 缺乏会破坏内质网 - 线粒体磷脂转移，并与内质网应激、脂质积累、炎症、纤维化和肝癌有关[32]。此外，MFN2 通过维持线粒体完整性和调节线粒体自噬来防止肝损伤。先前的证据表明，MFN2 促进 PINK1/Parkin 依赖的线粒体自噬，从而在肝脏缺血/再灌注期间保持线粒体质量控制并减轻肝细胞损伤[33]。MFN2 功能受损与肝脏脂肪变性、炎症反应和纤维化进展有关，突出了其在维持肝脏代谢稳态和细胞器通讯中的重要性。然而，MFN2 依赖的内质网 - 线粒体通讯破坏是否导致 OTA 诱导的肝毒性以及这一过程如何影响线粒体自噬和铁死亡仍有待确定。

作为负责代谢和解毒的核心器官，肝脏是毒物的主要靶器官。它也是 OTA 生物转化和积累的重要部位，这可能增加其对 OTA 诱导损伤的易感性 [34]。因此，阐明 OTA 对肝脏健康的潜在不良影响很重要。OTA 可以影响各种动物，其中鸡特别容易感染[35]。为了阐明 OTA 对肝脏的影响以及可能的调节机制，选择鸡作为体内模型，而选择原代鸡胚胎肝细胞 (CEHs) 作为体外模型。最近的研究表明，MFN2 在保持线粒体融合、线粒体自噬以及 MAMs 发育方面发挥着保护作用。然而，MFN2 在 OTA 诱导的肝毒性中的参与仍 largely 未被探索。本研究旨在阐明 MFN2 在 OTA 诱导的肝细胞铁死亡中的贡献，从而为减轻真菌毒素相关肝损伤提供新的机制见解和潜在靶点。

部分片段
OTA 的测定
使用 ELISA 试剂盒 (NCS Testing Technology Co., Ltd., 北京，中国) 测定 OTA 浓度。简而言之，用 25 mL 70% 甲醇提取 OTA 并充分混合。在 4000 rpm 离心 3 分钟后，随后根据制造商的方案使用 ELISA 试剂盒定量上清液中的 OTA 含量。

OTA 分布图
总结了全球 OTA 污染分布情况，以说明全球报告的检测水平。相关文献已被
OTA 暴露导致鸡的肝脏损伤和铁死亡
OTA 污染是全球日益关注的问题。如 OTA 地理分布图所示 (图 1A)，OTA 污染在全球范围内广泛存在，其中中国、美国、印度和加拿大的污染水平相对较高。OTA 报告系数的地理差异进一步揭示了中国和德国的报告活动较高，而美国和印度也观察到中等程度的增加值，表明区域差异在
讨论
OTA 是一种普遍存在的真菌毒素，在全球各种受污染的食品和动物饲料中普遍检测到，其广泛存在对全球食品安全构成了巨大挑战[48]。越来越多的证据表明，OTA 具有多种毒性效应，包括器官特异性损伤，如肾毒性和肝毒性，以及破坏多种生物过程，包括炎症、DNA 损伤、氧化应激和细胞死亡。然而，相对较低

结论
总之，本研究阐明 OTA 靶向 MFN2 并显著抑制其表达，破坏了内质网 - 线粒体通讯，损害了线粒体自噬，并增强了肝细胞中的铁死亡损伤。MFN2 的恢复改善了 MAMs 功能和线粒体质量控制，并减少了 OTA 诱导的铁死亡。我们的数据揭示了一种以前未被认识的机制，即 MFN2 在 OTA 诱导的铁死亡期间调节内质网 - 线粒体通讯和线粒体自噬。重要的是，MFN2

环境意义
赭曲霉毒素 A (OTA) 是一种持久性真菌毒素，对环境安全、动物生产和公众健康构成 substantial 风险。尽管 OTA 暴露已被与肝损伤联系起来，但将 OTA 污染与肝毒性联系起来的分子事件仍未被充分理解。在这里，我们发现 OTA 与 MFN2 相互作用，导致 MFN2 表达下调，从而破坏内质网 - 线粒体通讯，抑制线粒体自噬，并促进铁死亡。总体而言，

缩写
OTA, 赭曲霉毒素 A; IARC, 国际癌症研究机构; ER, 内质网; ROS, 活性氧; UPR, 未折叠蛋白反应; MAMs, 线粒体相关内质网膜; MFN2, 线粒体融合蛋白 2; ALT, 丙氨酸氨基转移ase; AST, 天冬氨酸氨基转移酶; LPO, 脂质过氧化; MDA, 丙二醛; GSH-Px, 谷胱甘肽过氧化物酶; H&E, 苏木精和伊红; CEHs, 原代鸡胚胎肝细胞; MCE, MedChemExpress; 3-MA, 3-甲基腺嘌呤; Pep-A, 胃蛋白酶抑制剂

资助
本研究得到了国家自然科学基金 (Grant No. 32402968)，中国黑龙江省自然科学基金杰出青年项目 (Grant No. YQ2023C017)，东北农业大学学术骨干项目 (Grant No. 54960212)，黑龙江省博士后基金 (Grant No. LBH-Z23010)，黑龙江省博士后特别资助 (Grant No. LBH-TZ2404)，中国博士后科学基金 (Grant No. 2023MD744173) 和博士后特别资助

CRediT 作者贡献声明
王一博：监督，资源，调查。刘卓宇：监督，资源，调查。江福伟：可视化，验证，软件。陈明山：方法论，数据整理。

赵毅：写作 – 审阅与编辑，项目管理，资金获取。欧阳宇轩：写作 – 初稿，形式分析，概念化。李金龙：写作 – 审阅与编辑，项目管理，资金获取。刘瑞奇：写作 – 初稿，形式分析，
利益冲突声明：作者声明他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本论文中报告的工作。
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东北农业大学动物医学院，中国黑龙江省哈尔滨市香坊区长江街 600 号 150030