生物膜相关的单菌种和双菌种细菌群落对聚乳酸（PLA）微珠的转化

《Journal of Hazardous Materials》：Biofilm-associated transformation of polylactic acid (PLA) microbeads by single- and dual-species bacterial communities

　　

生物膜形成是生物塑料生物降解的关键步骤，但降解过程常因微生物定殖不足和生物膜形成不稳定而受到限制。本研究考察了在M9基础培养基中30°C培养1天和7天后，单菌种（恶臭假单胞菌Pseudomonas putida、大肠杆菌Escherichia coli）和双菌种生物膜存在下聚乳酸（PLA）微珠的早期生物降解。PLA表面变化证实，双菌种生物膜引起了界面转化，表现为C=O键断裂、C-O和C-C键形成，以及PLA热稳定性降低，其中C=O原子比在7天后从26.1±0.50%降至16.0±1.11%。在多孔板中，双菌种生物膜的生物量高于单菌种，但在PLA微珠上的生物膜形成量低于单菌种恶臭假单胞菌。对双菌种生物膜中关键中间代谢物乳酸和丙酮酸水平的定量分析显示，两种菌之间存在代谢合作。降解性能的提高归因于增强的界面定殖和互补的代谢活性，二者共同促进了持续的聚合物水解。这些发现提出了一种可控的基于生物膜的策略，以提高PLA生物转化效率，并为设计用于聚合物生物降解过程的微生物菌群提供了见解。

**论文解读：双菌种生物膜对聚乳酸微珠的早期生物转化**

**研究背景与问题**

微塑料污染对水陆生态系统构成威胁，传统塑料的替代材料——生物塑料，如聚乳酸（polylactic acid, PLA），虽具有可生物降解性，但在常温（20–30°C）有氧环境中降解缓慢，可能长期残留。微生物在塑料表面的定殖和生物膜形成是生物降解的起始步骤，然而天然环境中微生物附着不足和生物膜不稳定常限制降解效率。已有研究表明，恶臭假单胞菌（*Pseudomonas putida*）偏好附着于PLA表面并促进其降解，而大肠杆菌（*Escherichia coli*）具有强生物膜形成能力。但二者共培养对PLA转化的影响尚未见报道。为此，研究人员提出假说：*P. putida*和*E. coli*可形成稳定的双菌种生物膜，加速PLA生物降解。该研究系统比较了单菌种与双菌种生物膜对PLA微珠的早期转化效率及机制，成果发表于《Journal of Hazardous Materials》。

**关键技术与方法**

研究人员采用摇瓶共培养体系，以50 μm PLA微珠为底物，在M9基础培养基中30°C培养1天和7天。菌株为*P. putida* KT2440-mCherry（香港教育大学Li Liguan博士惠赠）和*E. coli* ATCC25922-GFP（中国科学院微生物研究所Li Bao博士惠赠）。生物膜表征运用结晶紫染色定量生物量、ATP测定、XTT还原法检测代谢活性、EPS组分（多糖、蛋白质、胞外DNA）提取与定量；结构分析采用激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）结合BiofilmQ和COMSTAT软件；PLA表面化学变化通过X射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和热重分析（TGA）表征；形态学观察使用扫描电子显微镜（SEM）；乳酸和丙酮酸采用高效液相色谱（HPLC）定量；双菌种细胞计数使用流式细胞分选（FACS）。

**研究结果**

**3.1 单菌种和双菌种培养下PLA微珠的转化**
XPS结果表明，所有生物膜处理均使PLA表面C=O比例下降、C-C比例升高，其中双菌种处理在24 h内即出现显著碳键变化，且7天后C=O从26.1%降至16.0%，表明酯键水解和去氧反应更强烈。FTIR显示双菌种生物膜在7天后显著降低羰基指数，提示降解产物被进一步利用。TGA显示双菌种处理后PLA最终分解温度降低，说明分子量下降和热稳定性变差。SEM观察到双菌种处理表面出现孔隙和不规则结构。这些结果共同证实双菌种生物膜对PLA的界面转化更强。

**3.2 与PLA转化相关的生物膜特征**
**3.2.1 48孔板中生物膜的特征**
结晶紫染色和ATP测定显示，双菌种（*P. putida*:*E. coli* OD_{600 nm}比1:1）在聚苯乙烯板上生物量、ATP和多糖含量均显著高于单菌种，表明协同作用增强生物膜形成。蛋白质含量随*E. coli*比例升高而增加，但eDNA无显著差异。

**3.2.2 24小时内在PLA上的生物膜形成条件**
在PLA微珠上，单菌种*P. putida*生物量（OD_{590 nm} 4.91）最高，双菌种（2.51）次之，*E. coli*最低（2.11）。双菌种生物膜eDNA浓度（7.47 μg·mL^-1）最高，提示更稳定的结构。PLA表面粗糙度优于玻璃珠，更利于生物膜附着。尽管双菌种生物量低于*P. putida*单菌种，但PLA转化却更强，暗示功能协同而非单纯生物量起主要作用。

**3.2.3 7天内在PLA上的生物膜形成条件**
培养7天后，所有生物膜生物量较24 h下降，双菌种生物膜仍保持最高生物量和代谢活性。FACS显示*P. putida*细胞数始终高于*E. coli*，但总细胞数随时间减少，归因于营养耗竭和代谢产物积累。

**3.2.4 PLA微珠上的生物膜结构**
CLSM及定量分析显示，*P. putida*在PLA表面覆盖率和厚度均大于*E. coli*，且形成分层结构：*E. coli*位于内层，*P. putida*包裹在外层。这是*P. putida*专性需氧与*E. coli*兼性厌氧特性所致，双菌种的空间分布利于氧气梯度利用和代谢互补。

**3.3 与PLA转化相关的代谢物特征**
HPLC检测乳酸和丙酮酸显示，单菌种*E. coli*积累丙酮酸高、乳酸低；*P. putida*反之；双菌种两种代谢物浓度介于中间，且乳酸从24 h至7天增加。该结果说明双菌种通过代谢合作调节中间产物水平，避免乳酸积累抑制，同时促进PLA水解产物的进一步代谢。

**总结讨论**
总之，双菌种生物膜对PLA的早期转化并不取决于生物膜总量，而在于物种间的代谢合作与空间互作。*P. putida*提供外源乳酸利用能力，*E. coli*贡献强定殖能力，二者互补增强了界面水解和产物消耗。该研究为设计工程微生物菌群用于PLA生物处理提供了理论依据，未来需借助代谢组学和同位素示踪进一步验证机制，并在反应器尺度验证环境适用性。

**研究结论**
本研究考察了有氧条件下双菌种生物膜在基础培养基中加速PLA生物降解初期阶段的作用。通过C=O键断裂和中间产物消耗等关键指标量化，双菌种处理7天后PLA生物转化最为明显。*P. putida*单菌种在PLA上的生物量和ATP活性最高，而双菌种生物膜eDNA浓度最高。然而，生物量和EPS浓度本身与PLA转化速率并不相关。乳酸和丙酮酸分布模式表明，双菌种生物膜调控了这些关键代谢物的水平，从而防止其积累造成的抑制。总体而言，混合生物膜中PLA早期转化不仅与生物膜生物量相关，更受不同微生物物种间的代谢合作及其在PLA微珠表面的共定位和积累所支配。未来研究需结合代谢组学、同位素示踪及反应器规模验证，以阐明混合生物膜转化PLA的深层机制和环境适用性。