用于细胞摄取的DNA纳米结构的迭代筛选

《Advanced Materials》：Iterative Selection of DNA Nanostructures for Cellular Uptake

　　

DNA纳米技术（DNA nanotechnology）提供了精确、生物相容的结构，在靶向药物递送方面具有巨大潜力，然而当前的发现方法依赖于对单个设计的测试，限制了对结构多样性的探索。在本研究中，研究人员引入了一种迭代选择策略，用于筛选大型DNA纳米结构文库，每个结构由与扩增和测序兼容的单链“结构基因组”（structure genome）折叠而成。细胞内化被用作选择压力：将文库与哺乳动物细胞共孵育，从裂解物中回收内化的结构，并在HEK293T和RAW264.7细胞中进行多轮迭代。对回收的结构基因组进行高通量测序（high-throughput sequencing）揭示了细胞类型特异性的富集模式，从而能够识别具有优先摄取能力的单个纳米结构。选定的候选结构被合成并作为纯化结构进行评估，通过定量流式细胞术（flow cytometry）和显微镜（microscopy）确认了差异内化。将DNA纳米结构的发现转变为基于选择的过程，可以实现结构多样性的高通量探索，并为识别用于生物医学应用的具有细胞特异性摄取特性的纳米结构提供替代途径。

DNA纳米技术能够精确构建尺寸、形状和力学性质可控的自组装结构，在靶向药物递送中具有重要应用前景。然而，传统的设计优化依赖于逐一对单个结构进行测试，难以充分探索巨大的结构设计空间。为此，研究人员提出将结构发现转化为迭代筛选过程，以细胞摄取作为选择压力，从大型DNA纳米结构文库中高通量鉴定具有细胞偏好性的候选结构。该研究发表在《Advanced Materials》上。

研究人员构建了由36种DNA纳米结构片段组成的文库，这些片段包括线性、凸起、分支、发夹和kissing loop等多种几何构型，每个片段由1至5条寡核苷酸组装而成。通过粘性末端连接，片段随机组合成由单链“结构基因组”折叠的纳米结构，该结构基因组兼容PCR扩增和测序。随后在HEK293T和RAW264.7细胞中进行10轮摄取选择，在A549和MDA-MB-231癌细胞系中进行5轮选择，每轮回收内化结构，经裂解、扩增、λ外切酶消化和重折叠后进入下一轮。通过纳米孔（Nanopore）和Illumina测序监测富集动态，并利用cONcat等生物信息学工具解析结构基因组组成。选出的候选结构通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估细胞摄取。

**2.1 DNA纳米结构文库的设计与优化**
研究人员设计了36种结构片段，包括不同长度的线性片段、凸起片段、发夹、三向和四向连接等，所有片段带有定向粘性末端，确保连接时仅纳入一个扩增环。连接后经Exonuclease III消化去除未完全连接的产物，PCR优化确定60°C退火和15个循环为最佳条件。λ外切酶消化产生单链DNA，重折叠后通过AFM观察到多种结构形态。

**2.2 通过重复细胞摄取实验进行选择**
在HEK293T和RAW264.7细胞中进行10轮选择，每轮使用2 μg文库孵育4小时，经洗脱、裂解、纯化和PCR扩增回收内化结构。纳米孔测序显示HEK293T中人类基因组污染逐渐增加至约62%，而RAW264.7中低于7%。过滤后分析结构基因组长度分布，发现HEK293T选择后平均长度缩短并出现明显峰，RAW264.7则变化较小。

**2.3 细胞摄取中的结构偏好**
通过解码片段组成，发现两种细胞均偏好线性片段，而kissing loop片段被强烈负选。HEK293T中富集变化幅度大于RAW264.7。UMI条形码分析显示，HEK293T选择后238个UMI出现超过1000次，RAW264.7仅有11个，表明HEK293T选择压力更严格。对照实验（无细胞选择）未发现明显富集。

**2.4 从测序数据鉴定和生产候选结构**
从纳米孔数据中初步选出H5A-H5D，但后续发现这些序列含有基因组DNA嵌合体，可能来自PCR过程中DNA结构引物与基因组片段的非特异性延伸。从Illumina数据中，依据高UMI计数和无基因组污染，从RAW264.7和HEK293T各选出4个候选（R10A-D和H10A-D），并设置未选择对照（US-A-D）和随机对照（Random1-9）。最终14个候选用于后续实验。

**2.5 通过流式细胞术和显微镜对候选结构进行细胞剖析**
在HEK293T中，H10A和H10B产生最高的Cy5阳性细胞比例，而RAW264.7中R10B最高。在未选择的A549细胞中，总体摄取较低，但未选择对照US-C反而表现出最高摄取，提示筛选过程中的稳定性或扩增效率可能影响富集结果。共聚焦显微镜证实结构主要存在于胞质，部分在核内。在MDA-MB-231、MCF-7和HeLa细胞中，非富集候选反而普遍摄取更高，表明结构摄取具有强细胞类型依赖性。

**2.6 在癌细胞系中进行结构选择**
在MDA-MB-231和A549细胞中仅进行5轮选择，即观察到与之前类似的线性片段偏好和kissing loop负选，且富集幅度强于非癌细胞系10轮选择。UMI追踪显示单个结构显著富集，表明癌细胞系可能提供更强的选择压力。

**讨论与结论**
讨论指出，RAW264.7巨噬细胞的吞噬特性使其摄取无明显结构选择性，而HEK293T和癌细胞系表现出更明显的偏好。PCR偏差和结构稳定性是影响选择结果的平行压力。未来可结合计算工具优化文库设计，并整合适配体等功能基团。结论部分翻译如下：总之，研究人员开发了一种将DNA纳米结构细胞靶向从设计转变为选择过程的方法。研究人员构建了一类兼容扩增和测序的新型DNA纳米结构，并实现了以细胞摄取为选择压力的迭代筛选流程。研究证明细胞对特定类型的DNA纳米结构存在选择性偏好，但这种特异性高度依赖于细胞类型。该工具有望发现传统方法难以获得的DNA纳米结构，为目前缺乏有效疗法的疾病提供潜在靶向递送方案。