CD9+ B细胞诱导滤泡辅助性T细胞凋亡以调节生发中心消退

《Advanced Science》：CD9+ B Cells Induce T Follicular Helper Cell Apoptosis to Regulate Germinal Center Regression

　　

腺样体肥大（adenoid hypertrophy, AH）与生发中心B（germinal center B, GC-B）细胞的过度增殖相关，然而GC消退与终止的潜在机制仍知之甚少。本研究利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析了AH中GC-B细胞的细胞组成。通过全面的scRNA-seq、流式细胞术和质谱流式细胞术（mass cytometry, CyToF）分析，研究人员鉴定出一个表达CD9的独特GC-B细胞亚群，并进一步评估了CD9和FOXP1在GC-B细胞分化及凋亡通路中的作用。CD9⁺ B细胞在GC-B细胞发育全过程中均可检测到，并受FOXP1调控。这些细胞还表现出细胞死亡相关通路的激活，尤其在腺样体发育过程中。AH样本中滤泡辅助性T细胞（T follicular helper, Tfh）增加，同时CD9⁺ B细胞减少。在Cd9基因敲除小鼠中，CD9缺陷导致血清IgG水平显著降低。进一步分析揭示，CD9⁺ B细胞通过ALCAM-CD6等通路促进Tfh细胞凋亡。CD9⁺ B细胞可能通过诱导Tfh细胞凋亡来调节GC-B细胞消退，而FOXP1可能在其分化中发挥作用。这些发现阐明了GC退化和终止的机制，为AH治疗提供了潜在靶点。

**CD9⁺ B细胞通过诱导Tfh细胞凋亡调节生发中心消退的机制研究**

**一、研究背景与问题**

腺样体（咽扁桃体）属于咽淋巴环的一部分，在儿童鼻咽部免疫中发挥关键作用。腺样体肥大（adenoid hypertrophy, AH）是常见的儿科呼吸系统疾病，患病率约为9.9%–29.9%，且逐年上升。AH可引起鼻塞、咳嗽、打鼾、张口呼吸等症状，并可能导致阻塞性睡眠呼吸暂停和颅面发育异常。腺样体切除术虽有效，但存在麻醉并发症、术后出血和窒息等风险；药物治疗如鼻用糖皮质激素和白三烯受体拮抗剂疗效有限。腺样体组织中淋巴细胞为主要细胞群，B细胞占60%–70%。B细胞在T细胞辅助下于生发中心（germinal center, GC）分化为浆细胞和记忆B细胞。尽管GC形成机制研究较多，但驱动GC消退和终止的机制仍不清楚。Tfh细胞与B细胞的相互作用对GC形成和维持至关重要，因此理解这些细胞间的互作是揭示GC降解机制的关键。人类腺样体的发育和萎缩具有年龄依赖性，通常在成年期完全萎缩。然而，常用啮齿动物模型缺乏腺样体，且小鼠与人类免疫系统存在显著差异，限制了对腺样体的研究。scRNA-seq技术为解析复杂细胞系统提供了高分辨率手段，但既往人扁桃体单细胞图谱不能直接外推至儿童腺样体病理研究，因为腺样体与扁桃体在组织学结构、免疫防御机制和临床生物学特性上存在显著差异。因此，本研究拟通过scRNA-seq绘制腺样体组织GC-B细胞单细胞图谱，揭示GC形成与消退的调控机制。

**二、研究内容与结论**

研究人员对13例腺样体和5例扁桃体样本进行scRNA-seq分析，整合后获得91,741个细胞。通过无监督聚类鉴定出B细胞、浆细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、肥大细胞、单核细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和血管周细胞等细胞类型。与腺样体非肥大（ANH）组相比，AH组B细胞丰度显著升高，CD4⁺/CD8⁺ T细胞比例显著降低，且B细胞比例与腺样体大小呈正相关。对GC-B细胞亚群分析鉴定出7个亚群，包括3个暗区（DZ）相关亚群和4个亮区（LZ）相关亚群，其中LZ_CD9亚群（即CD9⁺ B细胞）高表达CD83、CD86、CD27等LZ标志基因，且其丰度在ANH组显著高于AH组。CD9⁺ B细胞高表达内质网应激相关基因（PDIA4、BIK、LMAN1）及Breg标志分子（CD24、CD38、CD27）。通过拟时序分析和基因调控网络分析，研究人员发现FOXP1可能是调控CD9⁺ B细胞分化的关键转录因子，且FOXP1敲低可显著降低CD19⁺CD9⁺CD27⁺ B细胞比例。相关性分析显示，CD9⁺ B细胞丰度与腺样体大小呈负相关，AH组CD9⁺ B细胞表现出更显著的坏死样形态和凋亡特征。细胞通讯分析揭示Tfh细胞与CD9⁺ B细胞间存在多种配体-受体互作（如ALCAM-CD6、LTA-TNFRSF1B、CD58-CD2）。体外实验证实，沉默Tfh细胞中相应配体（如TNFRSF1B、TIGIT、CD6、CD2、ICAM3）可增强CD9⁺ B细胞的CD27和IgG产生、减少IgM产生；而沉默CD9⁺ B细胞中的受体（如TNF、LTA、PRR3、ALCAM、CD58、ABL2）则显著抑制Tfh细胞凋亡。此外，Cd9基因敲除小鼠外周淋巴器官中GC-B细胞丰度显著降低，血清IgG1水平明显下降。研究结论为：CD9⁺ B细胞通过诱导Tfh细胞凋亡调节GC消退，FOXP1参与其分化调控，为AH治疗提供了新靶点。该研究发表在《Advanced Science》。

**三、主要关键技术方法**

本研究主要采用以下关键技术：1）单细胞RNA测序（scRNA-seq），使用10x Genomics和BD Rhapsody平台对13例腺样体和5例扁桃体样本进行测序，经Harmony算法整合；2）质谱流式细胞术（CyToF）验证B细胞和CD4⁺ T细胞亚群组成；3）流式细胞术（flow cytometry）检测细胞比例和凋亡；4）拟时序分析（Monocle 2）构建GC-B细胞分化轨迹；5）基因调控网络分析（pySCENIC）鉴定关键转录因子；6）细胞通讯分析（CellPhoneDB 2）预测细胞间配体-受体互作；7）反转录定量PCR（RT-qPCR）、Western blot、免疫荧光、透射电镜、ELISA、基因敲除小鼠模型及shRNA敲低实验验证关键分子功能。样本队列来源为广州医科大学附属第一医院伦理委员会批准的临床样本（2022-145），并注明成人残存腺样体样本被排除。

**四、研究结果**

**2.1 腺样体和扁桃体组织的单细胞图谱**
通过scRNA-seq分析18个样本（13例腺样体、5例扁桃体），整合后得到91,741个细胞，鉴定出10种主要细胞类型。AH组织B细胞丰度显著升高，CD4⁺/CD8⁺ T细胞比例降低，且B细胞丰度与腺样体大小正相关（R=0.9, p=3.5e-08）。

**2.2 腺样体发育过程中GC-B细胞的生态学**
对GC-B细胞亚群分析鉴定出7个亚群（DZ_CDC20、DZ_TK1、DZ_TXN、LZ_CD9等）。CD9⁺ B细胞（LZ_CD9）主要处于G1期，高表达LZ标志基因。与ANH组相比，AH组CD9⁺ B细胞丰度显著降低。富集分析显示CD9⁺ B细胞中内质网（ER）应激相关通路显著激活，RT-qPCR和Western blot验证ER应激相关基因（PDIA4、BIK、LMAN1）在CD9⁺ B细胞中上调。

**2.3 FOXP1可能是腺样体CD9⁺ B细胞分化的潜在调控因子**
CytoTRACE和Monocle2拟时序分析显示CD9⁺ B细胞分布于GC-B细胞分化全轨迹。基因调控网络分析（pySCENIC）揭示FOXP1是CD9⁺ B细胞特异性的调控因子，其表达模式与CD9相似。实验证实CD9⁺ B细胞中FOXP1的RNA和蛋白水平均高于CD9^? B细胞；FOXP1敲低后CD19⁺CD9⁺CD27⁺ B细胞比例显著降低。

**2.4 CD9⁺ B细胞是调控腺样体发育和萎缩的关键亚群**
CD9⁺ B细胞丰度与腺样体大小呈负相关（R=-0.59, p=0.043），流式细胞术和免疫荧光证实ANH组CD9⁺ B细胞比例更高。CyToF分析也证实ANH组CD9⁺ B细胞丰度高于AH组。Cd9基因敲除小鼠中，脾脏、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结的GC-B细胞丰度显著降低，血清IgG1水平显著下降。

**2.5 CD9⁺ B细胞在腺样体发育阶段显著激活细胞死亡相关信号**
AH组CD9⁺ B细胞中ZFAS1、PFN1、MIF等基因显著上调，差异基因富集于细胞衰老、缺氧、氧化应激和细胞死亡相关通路。透射电镜显示AH组CD19⁺CD9⁺ B细胞呈现更多坏死样形态（质膜破裂、胞质和细胞器肿胀、内容物泄漏），流式细胞术确认AH组CD19⁺CD9⁺ B细胞凋亡比例更高。

**2.6 Tfh细胞丰度增加促进腺样体发育并与CD9⁺ B细胞丰度降低相关**
AH组Tfh细胞（CD4⁺CXCR5⁺PD-1⁺）丰度显著高于ANH组，且Tfh细胞丰度与CD9⁺ B细胞丰度呈显著负相关（R=-0.67, p=0.017）。CyToF、流式细胞术和多重免疫荧光均验证了Tfh细胞在AH中的增加，但CD9⁺ Tfh细胞比例在两组间无显著差异。

**2.7 CD9⁺ B细胞可能通过诱导Tfh细胞凋亡调节GC消退**
细胞通讯分析显示Tfh细胞与CD9⁺ B细胞间存在显著互作，包括ALCAM-CD6、LTA-TNFRSF1B、CD58-CD2等配体-受体对。体外共培养实验表明，沉默Tfh细胞中配体基因可促进CD9⁺ B细胞CD27和IgG产生并抑制IgM产生；沉默CD9⁺ B细胞中受体基因则抑制Tfh细胞凋亡。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，CD9⁺ B细胞丰度与腺样体大小负相关，可能通过ER应激和坏死途径导致自身数量减少。FOXP1作为转录抑制因子，可能调控CD9⁺ B细胞分化，进而影响GC消退。缺氧可能是引起ER应激的因素之一。Tfh细胞与CD9⁺ B细胞间的ALCAM-CD6轴在免疫调节中发挥重要作用。研究局限性包括单细胞测序深度有限、样本量小、缺乏临床验证，以及啮齿动物缺乏腺样体无法原位观察。未来可通过过继转移和人类化小鼠模型进一步验证。结论部分翻译：总之，研究结果表明，在腺样体发育过程中，高丰度的Tfh细胞抑制CD9⁺ B细胞的成熟和分化；随着腺样体发育逐渐改善，CD9⁺ B细胞数量显著增加，从而通过促进Tfh细胞凋亡调节GC消退。这些发现填补了GC退化和最终终止调控机制的空白，并可能为AH等疾病的治疗提供新见解。