《Advanced Science》：WTAP Transcriptional Suppression by KLF9 Drives Osteoclastogenesis via M6A-Mediated Regulation of CSF1R Signaling in Estrogen-Deficient Osteoporosis
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骨质疏松症以骨稳态失衡为特征，由过度破骨细胞介导的骨吸收驱动，然而通过m6A修饰进行的表观转录调控仍不清楚。在此，研究人员鉴定了WTAP（Wilms瘤1相关蛋白），作为m6A甲基转移酶复合物的一个组分，是破骨细胞生成的关键负调控因子。髓系特异性Wtap敲除小鼠
骨质疏松症以骨稳态失衡为特征，由过度破骨细胞介导的骨吸收驱动，然而通过m6A修饰进行的表观转录调控仍不清楚。在此，研究人员鉴定了WTAP（Wilms瘤1相关蛋白），作为m6A甲基转移酶复合物的一个组分，是破骨细胞生成的关键负调控因子。髓系特异性Wtap敲除小鼠加剧了破骨细胞形成和骨质疏松性骨丢失。机制上，WTAP介导Csf1r mRNA上的m6A沉积，通过关键m6A阅读蛋白YTHDF2促进其降解，并下调CSF1R表达，从而在雌激素缺乏性骨质疏松症中增强破骨细胞生成和骨丢失。研究人员进一步发现，在破骨细胞分化过程中诱导表达的KLF9转位至细胞核，直接抑制Wtap转录，从而启动这一病理过程。在破骨前体细胞中同时条件性敲除KLF9可挽救体内髓系特异性Wtap缺陷所驱动的加剧的骨质疏松性骨丢失。该KLF9/WTAP/YTHDF2/m6A/CSF1R轴建立了一个调控骨吸收的新型表观遗传回路。在治疗上，通过AAV介导的Wtap过表达或采用培西达替尼（pexidartinib）进行药理学CSF1R抑制，可有效改善骨质疏松小鼠的骨丢失。研究人员的发现阐明了一种先前未被认识的控制破骨细胞生成的表观转录机制，并强调了其对病理性骨吸收的治疗潜力。
论文解读：KLF9/WTAP/YTHDF2/m6A/CSF1R轴在雌激素缺乏性骨质疏松症中的调控机制
骨质疏松症（osteoporosis, OP）是全球性的公共卫生问题，以骨重塑失衡为特征，破骨细胞介导的过度骨吸收起决定性作用。N6-甲基腺苷（m6A）是其核生物中最普遍的内部RNA修饰，在转录后基因调控中发挥关键作用，并日益被认为是骨稳态的重要调节因子。m6A修饰由“Writer”（甲基转移酶复合物）、“Eraser”（去甲基化酶）和“Reader”（结合蛋白）动态可逆地调控，决定mRNA的稳定性、剪接、出核和翻译。其中METTL3-METTL14-WTAP复合物构成核心m6A“Writer”复合物，但现有文献对其各组分在破骨细胞分化中的具体功能存在看似矛盾的结论。WTAP作为该复合物的关键支架组分，其在破骨细胞分化和OP中的作用尚不清楚，且调控m6A调节因子本身表达的上游机制，尤其是转录调控层面，仍基本未被探索。因此，研究人员开展了本研究，旨在阐明WTAP在破骨细胞生成和OP进展中的功能及机制。
研究人员通过整合多组学分析、细胞与分子生物学实验以及遗传小鼠模型，鉴定并验证了一条先前未被认识的KLF9/WTAP/YTHDF2/m6A/CSF1R调控轴。研究发现，转录因子KLF9在破骨细胞生成过程中上调并发生核转位，直接结合并抑制Wtap转录，导致WTAP表达下调，进而减少Csf1r mRNA上的m6A沉积，减弱m6A阅读蛋白YTHDF2介导的Csf1r mRNA降解，使CSF1R表达升高，最终驱动过度破骨细胞形成和骨丢失。该研究发表于《Advanced Science》。
主要关键技术方法包括：使用单细胞RNA测序数据（GSE147287）和 bulk RNA-seq数据（GSE246769）进行生物信息学分析；利用骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）和人外周血单核细胞（hPBMCs）进行体外破骨细胞分化实验；构建髓系特异性Wtap条件敲除（WTAP CKO）小鼠（Wtap
flox/flox; Lyz2-CreERT2）及OVX诱导的OP模型；采用MeRIP-seq和RNA-seq联合分析鉴定m6A靶基因；通过ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因实验验证KLF9对Wtap启动子的直接结合与转录抑制；使用AAV-shKLF9和AAV-oeWtap进行体内基因干预；使用CSF1R抑制剂PLX3397进行药理学干预。样本队列来源包括苏州大学附属第一医院16例接受全膝关节置换术的女性患者（8例OP，8例非OP对照）。
研究结果如下：
2.1 WTAP在OP患者和OVX小鼠破骨细胞生成过程中表达下降：通过scRNA-seq分析发现WTAP在OP患者骨髓巨噬细胞亚群中表达，且随破骨分化逐渐下降；OP患者骨组织WTAP阳性细胞显著减少，并与血清CTX-1水平呈负相关；OVX小鼠骨组织WTAP表达亦降低，且与C-fos阳性破骨前体细胞共定位减少；RANKL诱导的BMDMs中WTAP在mRNA和蛋白水平均时间依赖性下调，但总体m6A水平保持稳定。
2.2 WTAP干预在体内外反向调控破骨细胞生成和OP发病：siRNA敲低Wtap促进BMDMs破骨标志基因表达和多核细胞形成，而过表达Wtap则抑制；WTAP CKO小鼠在OVX后表现出更严重的骨丢失，骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）降低，骨小梁分离度（Tb.Sp）增加，血清CTX-1升高，股骨最大载荷下降；年龄相关性骨丢失中WTAP CKO未显示显著加剧。
2.3 WTAP依赖的m6A修饰靶向Csf1r调控破骨细胞生成：MeRIP-seq显示Wtap过表达后m6A峰值主要富集于3'UTR，Csf1r mRNA同时出现转录下调和m6A高甲基化；WTAP敲低上调CSF1R表达，过表达下调；MeRIP-qPCR证实WTAP调节Csf1r mRNA的m6A水平；Actinomycin D实验显示WTAP调控Csf1r mRNA稳定性；CSF1R共敲低可部分逆转Wtap敲低促进的破骨细胞生成；人hPBMCs中验证了保守作用。
2.4 WTAP通过YTHDF2介导的CSF1R mRNA稳定性调控破骨细胞生成：生物信息学分析鉴定YTHDF2为关键阅读蛋白；WTAP敲低降低YTHDF2表达；RIP-PCR证实YTHDF2直接结合Csf1r mRNA，且WTAP敲低减弱该结合；Ythdf2共敲低可逆转Wtap过表达导致的Csf1r mRNA加速降解和CSF1R表达下调，并恢复破骨细胞形成。
2.5 KLF9可能作为WTAP上游调控破骨细胞生成和OP进展：整合分析筛选出转录因子KLF9；OP患者和OVX小鼠骨组织KLF9表达升高；RANKL诱导过程中KLF9 mRNA和蛋白水平上调；KLF9敲低抑制破骨细胞分化，过表达促进；AAV-shKLF9可缓解OVX小鼠骨丢失。
2.6 KLF9通过核转位后直接结合DNA转录抑制WTAP表达：ChIP-qPCR证实KLF9直接结合Wtap启动子区域（?528至?516 bp）；双荧光素酶报告基因证实KLF9通过该位点抑制Wtap转录；KLF9敲低减弱RANKL诱导的Wtap下调，过表达增强；RANKL刺激诱导KLF9从细胞质转位至细胞核。
2.7 KLF9通过WTAP依赖途径调控破骨细胞生成和OP进展：体内外救援实验表明，在WTAP CKO背景下，AAV-shKLF9无法挽救骨丢失和破骨细胞活性；WTAP共敲低可消除KLF9敲低对CSF1R表达的抑制作用；Ythdf2敲低同样消除KLF9敲低对CSF1R的抑制，证明KLF9通过WTAP-YTHDF2通路发挥作用。
2.8靶向破骨前体细胞中的WTAP-CSF1R轴可改善OVX诱导的骨质疏松：AAV介导的Wtap过表达在OVX小鼠中部分缓解骨丢失，降低破骨细胞数量和血清CTX-1水平；CSF1R抑制剂PLX3397（培西达替尼）以剂量依赖性方式改善OVX小鼠骨小梁参数和骨强度，高剂量组效果接近阿仑膦酸钠。
讨论部分指出，m6A修饰在破骨细胞介导的骨吸收中形成精细调控网络，WTAP作为无内在甲基转移酶活性的支架蛋白，是m6A“Writer”复合物的核心组织者。研究还揭示了m6A调控基因本身受转录因子调控的多层次表观遗传-表观转录交互作用。研究局限性包括老年模型中WTAP作用未达统计学显著、KLF9上游信号不明、Lyz2-CreERT2系统的特异性限制以及PLX3397全身用药可能影响组织驻留巨噬细胞等。
结论：本研究阐明了一条新的KLF9/WTAP/YTHDF2/m6A/CSF1R调控轴，控制破骨细胞生成和OP进展。转录因子KLF9在破骨细胞分化中被诱导，转录抑制WTAP；WTAP表达降低减少CSF1R mRNA的m6A甲基化，从而减弱YTHDF2介导的降解，升高CSF1R蛋白水平，最终调控破骨细胞形成。这些发现揭示了一个控制破骨细胞介导骨吸收的关键表观转录机制，并强调了靶向该通路的治疗潜力，CSF1R抑制剂PLX3397的疗效即为佐证。
