《Advanced Science》：SerpinA3 is an Endogenous TGF-β Receptor Antagonist that Attenuates Cardiac Fibroblast Activation and Fibrotic Remodeling
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背景：心脏纤维化是心脏不良重塑和心力衰竭（HF）的核心驱动因素，然而有效的抗纤维化疗法仍然有限。SerpinA3是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员，已被认为与心血管疾病相关，但其在心脏重塑中的功能作用和潜在机制尚不明确。
方法与结果：研究人员采用横向主动脉缩窄
背景：心脏纤维化是心脏不良重塑和心力衰竭（HF）的核心驱动因素，然而有效的抗纤维化疗法仍然有限。SerpinA3是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员，已被认为与心血管疾病相关，但其在心脏重塑中的功能作用和潜在机制尚不明确。
方法与结果：研究人员采用横向主动脉缩窄（TAC）模型，观察到衰竭小鼠心脏和循环中SerpinA3K的表达显著降低。药理学补充或基因增强SerpinA3可显著改善压力超负荷引起的心脏功能障碍和纤维化重塑。单细胞转录组分析进一步表明，SerpinA3通过促进活化和细胞外基质产生型成纤维细胞向静息、促血管生成状态转变，从而抑制促纤维化成纤维细胞程序。机制上，SerpinA3与转化生长因子-β受体1型（TGFR-1）的胞外域结合，并破坏TGF-β受体1型-TGF-β受体2型复合物的形成，从而阻止心脏成纤维细胞中下游Smad2/3磷酸化。
结论：SerpinA3作为TGF-β信号的内源性抑制剂，可抑制心脏成纤维细胞活化和纤维化重塑。通过靶向受体复合物组装，SerpinA3提供了一种调节促纤维化信号的选择性机制。这些发现将SerpinA3确定为与病理性纤维化相关的心力衰竭的一个有前景的治疗靶点。
心脏纤维化是心力衰竭（HF）进展的核心驱动因素，以心脏间质细胞过度活化和细胞外基质（ECM）异常沉积为特征，导致左心室僵硬和功能障碍。尽管TGF-β信号通路已被确认为成纤维细胞活化的关键调控者，但目前缺乏有效且安全的抗纤维化治疗策略。小分子TGFR-1激酶抑制剂虽在实验模型中显示疗效，但因剂量限制性心脏毒性阻碍了临床转化。SerpinA3作为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，其在心脏重塑中的功能作用和机制尚不明确。
研究人员利用横向主动脉缩窄（TAC）压力超负荷小鼠模型，结合串联质谱标签（TMT）定量蛋白质组学、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、腺相关病毒（AAV）介导的基因过表达及分子生物学实验，系统阐明了SerpinA3在心脏纤维化中的功能与机制。研究发现SerpinA3通过结合TGF-β受体1型（TGFR-1）的胞外域，阻断TGFR-1-TGFR-2受体复合物组装，从而抑制Smad2/3磷酸化和成纤维细胞活化，改善压力超负荷诱导的心脏功能障碍和纤维化重塑。该研究确立了SerpinA3作为内源性TGF-β受体拮抗剂的新功能，为心力衰竭治疗提供了新靶点。论文发表在《Advanced Science》。
主要技术方法包括：①TMT定量蛋白质组学（C57BL/6J小鼠左心室，TAC术后8周与假手术组比较，n=3）；②10x Genomics单细胞RNA测序（TAC+SerpinA3处理组与TAC+生理盐水组各3个左心室，共18838个细胞）；③AAV9-Postn-SerpinA3肌成纤维细胞特异性基因过表达；④免疫共沉淀（co-IP）、邻近连接分析（PLA）、分子对接（Cluspro2.0/PyMol）等蛋白相互作用分析技术；⑤超声心动图、组织学染色、免疫荧光和Western blot等表型评价技术。
研究结果部分：
2.1 SerpinA3K在衰竭心脏中表达降低
通过TMT定量蛋白质组学分析发现，TAC术后8周小鼠左心室中共有130个差异表达蛋白（33个上调、97个下调）。Gene Ontology分析显示丝氨酸型蛋白酶抑制剂活性相关蛋白显著富集，其中SerpinA3K（人SerpinA3的功能直系同源物）是下调最显著的蛋白。Western blot、免疫荧光和血浆检测进一步证实TAC心脏组织和血浆中SerpinA3K水平显著降低，同时纤维化标志物Collagen I、POSTN、CCN2表达升高。细胞定位分析表明SerpinA3K主要表达于成纤维细胞、肌成纤维细胞和内皮细胞，TAC后成纤维细胞和肌成纤维细胞中SerpinA3K表达显著减少。
2.2 SerpinA3改善压力超负荷诱导的心脏功能障碍和重塑
给予重组人SerpinA3蛋白（100 μg/kg，腹腔注射，每3天一次，共8周）可显著恢复TAC小鼠的射血分数（EF）和缩短分数（FS），降低心脏重量与体重比（HW/BW）和心脏重量与胫骨长度比（HW/TL），减轻心肌细胞肥大、心肌纤维化面积和胶原沉积，抑制α-SMA在vimentin阳性成纤维细胞中的表达，并提高小鼠存活率。
2.3 SerpinA3抑制衰竭心脏中的心脏成纤维细胞活化
scRNA-seq共鉴定11种主要心脏间质和免疫细胞类型及9个成纤维细胞亚群（CF1-CF9）。SerpinA3治疗显著降低活化型和ECM产生型成纤维细胞亚群比例（CF1：11.90% vs 31.57%；CF2：13.16% vs 17.98%；CF4：6.26% vs 17.27%），增加静息态成纤维细胞比例（58.93% vs 24.87%）。RNA速率分析和Monocle拟时序分析显示，SerpinA3促进成纤维细胞从活化状态向静息、促血管生成状态（CF5、CF7）转变。
2.4 SerpinA3抑制TGF-β信号通路及TGF-β诱导的心脏成纤维细胞活化
差异基因分析及GO富集分析显示SerpinA3下调的基因富集于ECM组织、细胞黏附、TGF-β受体信号通路等通路。Western blot证实SerpinA3降低TAC心脏中Smad2/3磷酸化及CCN2、POSTN、Collagen I蛋白表达。体外实验表明，SerpinA3剂量依赖性地抑制TGF-β1诱导的Smad2/3磷酸化和核转位，并抑制成纤维细胞迁移、增殖（CCK-8）、胶原凝胶收缩及肌成纤维细胞表型转化。
2.5 SerpinA3结合TGFR-1并破坏TGFR-1-TGFR-2复合物形成
Co-IP实验证实内源性SerpinA3与TGFR-1存在特异性相互作用，并在HEK293T细胞中通过FLAG/HA双标签互作实验得到验证，PLA分析进一步确认了该原位相互作用。结构域截短实验表明SerpinA3与TGFR-1胞外域（ECD）结合而非胞内域（ICD）。分子对接预测了SerpinA3与TGFR-1的稳定结合模式。功能实验显示SerpinA3显著减少TGF-β诱导的TGFR-1向TGFR-2的募集以及TGFR-1-TGFR-2复合物的形成。
2.6 心脏SerpinA3过表达减轻压力超负荷诱导的心脏功能障碍和重塑
研究人员构建了由肌成纤维细胞特异性POSTN启动子驱动人SerpinA3表达的AAV9载体（AAV9-Postn-SerpinA3），尾静脉注射后行TAC手术8周。SerpinA3过表达显著恢复EF和FS，降低HW/BW和HW/TL比值，减轻心肌细胞肥大、纤维化面积和胶原沉积，抑制α-SMA表达，并降低Smad2/3磷酸化及CCN2、POSTN、Collagen I的表达。
讨论部分总结了本研究的核心发现：SerpinA3是压力超负荷诱导心脏重塑中此前未被识别的重要调控因子。与既往研究中SerpinA3C和SerpinA3N的心脏保护作用一致，本研究确立了SerpinA3在体内调节病理性心脏重塑的直接功能作用。与系统性小分子TGFR-1激酶抑制剂不同，SerpinA3作为成纤维细胞自身分泌的内源性蛋白，在心脏间质局部发挥作用，通过靶向受体胞外域选择性阻断促纤维化信号，同时保留TGF-β的系统性生理功能，因此可能是一种更安全的抗纤维化治疗策略。
研究结论：SerpinA3通过直接结合TGFR-1胞外域并阻止TGFR-1-TGFR-2受体复合物形成，抑制SMAD2/3活化和成纤维细胞表型转化，从而限制压力超负荷下病理性ECM沉积和不良心脏重塑，是心力衰竭的潜在治疗靶点。
