志贺毒素中和作用的结构基础：靶向经典受体结合位点与非经典组装位点的人源抗体研究

《Advanced Science》：Structural Basis of Shiga Toxin Neutralization by Human Antibodies Targeting Canonical Receptor-Binding and Non-Canonical Assembly Sites

　　

产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）感染可引起严重全身并发症，而靶向抗毒素治疗仍是未满足的临床需求。研究人员从STEC毒素靶向的人源单克隆抗体（mAb）中分离出一组候选物，并表征了两种强效中和候选抗体RDS045与RDS059。人源mAb RDS059与志贺毒素1a B亚基（Stx1aB）复合物的冷冻电镜（cryo-electron microscopy）结构显示，RDS059识别Stx1aB表面暴露的环区，直接与宿主糖脂globotriaosylceramide（Gb3）竞争，阻断毒素-细胞结合。相比之下，RDS045结合Stx1aB五聚体界面处的非经典四级表位，通过广泛的氢键和阳离子-π相互作用网络充当原聚体间夹钳。两种抗体在细胞实验和体内小鼠Stx1a攻击模型中均提供强效保护。综上，该工作定义了志贺毒素受体阻断与组装干扰两种不同分子蓝图，为STEC治疗开发建立了机制框架。

研究背景与立项依据

产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）感染可引发出血性结肠炎（HC）、溶血性尿毒综合征（HUS）及中枢神经损伤，其中典型HUS约90%由Stx驱动。Stx家族为A-B₅异六聚体，A亚基灭活核糖体，B₅五聚体识别宿主Gb3介导附着。临床缺乏获批靶向药，抗生素可能促毒素释放，既有抗Stx抗体（Shigamabs、Urtoxazumab）已终止，马源F(ab′)₂ INM-004尚在Ⅲ期。因此，发现人源、机制多样的中和抗体具明确未满足需求。该文发表于《Advanced Science》，研究人员通过人源单B细胞平台分离Stx1aB特异性记忆B细胞，获得RDS045与RDS059两株强效mAb，借冷冻电镜（cryo-EM）解析2.00 ?（RDS059）与2.12 ?（RDS045）复合物结构，并在小鼠致死攻击模型中验证疗效，定义“受体面阻断”与“五聚体侧向夹钳”两类中和蓝图。

主要关键技术方法（≤250字）

研究人员采集中山大学附属第五医院伦理审批下肾病异常住院患者血清筛查，取高反应者Ep040外周血单核细胞（PBMC），以多色流式分选Stx1aB⁺ CD27⁺ IgD^?记忆B细胞，单细胞RT-PCR扩增高变区并重组表达68株IgG/IgA；以表面等离子共振（SPR）定KD，VeroE6细胞CCK-8测中和IC₅₀；Fab-抗原复合物经尺寸排阻后上300 kV Titan Krios G4收cryo-EM数据，cryoSPARC处理、AlphaFold3初模+Coot/Phenix精修至原子级；点突变丙氨酸扫描+ELISA/流式验证表位；生物膜层干涉（BLI）做竞争；BALB/c小鼠腹腔Stx1a（2×LD₅₀）攻毒1 h后单剂抗体给药，21天生存与血生化评估。

研究结果

2.1 血清筛选与单B细胞克隆鉴定 Leading 抗体

ELISA筛7例肾病患者血清，Ep040反应最强；分选其记忆B细胞获68对Ig，ELISA复筛4株结合Stx1aB（RDS005/036/045/059），SPR示RDS045 KD 8.76 nM、RDS059 8.89 nM；VeroE6保护仅RDS045、RDS059呈剂量依赖（RDS005/036无保护），定为后续结构主角。

2.2 mAb在Stx1aB五聚体上结合模式迥异

cryo-EM显示RDS059以1:1 Fab:原聚体对称占顶侧Gb3结合面，与Gb3空间重叠；RDS045占侧向原聚体间界面，跨两相邻protomer，近A亚基装配侧。叠加显示两表位仅53–55残基微重叠，BLI互抑不完全（RDS059预结合抑RDS045 72.3%，反之40.7%），证空间排斥而非完全竞争。

2.3 RDS059以loop5为中心遮断受体面

原子界面示RDS059重链CDR1/2/3与轻链CDR2借Tyr34-Asn55、Ser62-Asn32氢键及Trp107-H58 π–π堆积锚定loop5；叠合Gb3-STx1aB结构证其伸入三Gb3占位；丙氨酸扫描T54A/H58A/G60A/S64A降结合，H58A流失细胞竞争，结论：loop5中心表位+芳香堆积实现受体面广域位阻。

2.4 RDS045识别非经典侧向四级表位

RDS045重链CDR2/3与轻链CDR1跨protomer A/B成氢键网，轻链CDR3之Trp94插入protomer A疏水袋与Arg69成cation-π；叠合全毒素（PDB 1DM0）示其轻链近A亚基118–129区，五聚体核心RMSD 0.829 ?，无全局重排但限A亚基装配。保守性绘图示该侧向斑在Stx1a亚型较保守，不依赖Gb3竞争。

2.5 小鼠攻毒治疗效力

BALB/c腹腔Stx1a 0.1 mg/kg（2×LD₅₀），1 h后单剂IP给药。RDS045 5 mg/kg、RDS059 3 mg/kg组21天存活100%；低剂量部分保护。血尿素氮（BUN）、肌酐、总胆红素升至毒素组水平近正常，等型对照无效。两抗体器官保护等效，证暴露后治疗可行。

讨论与结论翻译

研究人员讨论指出，STEC-HUS无靶向药，RDS045与RDS059在人源平台下单次分离即覆盖“经典受体面”与“非经典五聚体侧向”两机制，补足既往骆驼VHH纳米抗体（Nb113/NbStx2e1）仅受体面范式；RDS045之interprotomer clamp借氢键+cation-π稳占装配界面，拓展可成药表面。局限含仅测Stx1a、未覆盖Stx2高致病亚型、小鼠模型未还原人肠-血流动力学、68株中仅4株结合反映记忆B低频。结论原文意译：本研究以人源单B细胞发现两株完全人源mAb，借cryo-EM在原子级界定RDS059之Gb3竞争型受体阻断与RDS045之原聚体间夹钳型组装干扰，两者在细胞与小鼠致死模型均全保护，为STEC抗毒素提供了机制互补的结构框架与临床前基石。