雄性小鼠下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素神经元（PVNCRH）的全脑单突触输入与输出

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Whole-Brain Monosynaptic Inputs and Outputs of Corticotropin-Releasing Hormone Neurons of the Paraventricular Nucleus of the Hypothalamus in Male Mice

　　

**摘要**

**目的** 下丘脑室旁核（paraventricular nucleus of the hypothalamus，PVN）是整合神经内分泌、自主神经和行为反应的中枢枢纽。PVN中的促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）神经元（PVN^CRH）在应激反应、焦虑和动机中发挥关键作用。然而，PVN^CRH神经元在全脑范围内的单突触输入-输出架构尚未完全明确，这限制了基于神经环路的功能解析。

**方法** 研究人员在CRH-Cre小鼠中，利用Cre依赖型修饰狂犬病毒进行逆行单突触示踪，并利用腺相关病毒进行顺行示踪，系统性地绘制了PVN^CRH神经元的全脑输入和输出图谱。

**结果** PVN^CRH神经元接受来自55个脑区的直接输入，其中间脑区域的贡献占主导地位，并总体呈现同侧偏好（61.4%）。值得注意的是，高度特异性的输入源自腹侧海马CA1区和伏隔核核心。PVN^CRH神经元还向全脑发出广泛的轴突投射。这些输出汇聚到多个环路模块，其中向情绪相关核团和自主神经调节中枢的投射尤为密集。

**结论** 本研究建立了PVN^CRH神经元全脑单突触输入-输出图谱。所获得的神经解剖学框架描绘了其与应激、情绪、自主神经和呼吸相关环路的广泛连接，为未来在环路水平研究应激相关精神疾病和系统性自主神经功能失调提供结构基础。

**论文解读：雄性小鼠下丘脑室旁核CRH神经元全脑单突触输入-输出图谱的构建与意义**

**1 研究背景与科学问题**

下丘脑室旁核（paraventricular nucleus of the hypothalamus，PVN）是中枢神经系统整合神经内分泌、自主神经和行为反应的关键枢纽，对维持机体稳态和介导应激适应至关重要。PVN包含功能异质的神经元亚群，其中表达促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）的神经元（PVN^CRH）是启动下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴的主要神经元群体。除了经典的内分泌功能外，近期研究表明PVN^CRH神经元还通过谷氨酸等快速神经递质的共释放，直接调控焦虑、奖赏、自主神经功能和应激相关行为。尽管针对PVN^CRH神经元的功能研究已广泛开展，但其全脑范围内的单突触输入和输出解剖架构仍不完整，这限制了对该神经元群体如何整合信息并协调多系统应激反应的深入理解。因此，系统绘制PVN^CRH神经元的全脑连接组，对于阐明其在生理和病理状态下的作用机制具有重要意义。

**2 研究技术与方法**

为实现对PVN^CRH神经元全脑连接组的解析，研究人员采用基于Cre-loxP系统的病毒示踪策略，在成年雄性CRH-IRES-Cre小鼠（品系编号012704，Jackson Laboratory，8-10周龄）中进行实验。研究分为两个队列：逆行单突触示踪组（n=5）和顺行示踪组（n=3）。

关键技术方法包括：第一，Cre依赖型改良狂犬病毒（RV-EnvA-ΔG-tdTomato）介导的逆行单突触示踪，通过预先在PVN注射Cre依赖的辅助病毒（AAV-DIO-TVA-GFP和AAV-DIO-RG），实现仅对起始神经元进行单突触级别的上游输入全脑绘制；第二，Cre依赖型腺相关病毒（rAAV9-EF1α-DIO-EYFP-WPRE）介导的顺行示踪，用于全面描绘PVN^CRH神经元的轴突投射模式；第三，RNAscope荧光原位杂交（RNAscope-FISH）技术验证病毒标记神经元与内源性Crh mRNA的共定位情况；第四，利用显微镜扫描系统获取全脑切片图像，并结合Fiji和ImageJ软件进行半自动化的阳性神经元计数和轴突荧光面积定量分析。所有实验程序均经河北医科大学动物护理与伦理委员会批准。

**3 研究结果**

**3.1 靶向标记PVN^CRH神经元的实验策略**

研究人员首先验证了病毒示踪系统的特异性和有效性。通过RNAscope-FISH分析，确认GFP⁺与Crh⁺共标记神经元占计数神经元总数的51.3%（n=156个细胞）。免疫荧光成像显示起始细胞（同时表达GFP和tdTomato）严格局限于PVN边界内。在野生型小鼠中未检测到任何标记神经元，证实了该系统的Cre依赖性。对5只小鼠的定量分析显示，起始细胞数量与标记的输入神经元总数之间存在线性正相关关系，表明病毒在样本间具有一致的跨突触效率，支持了逆行示踪的稳定性和可重复性。

**3.2 PVN^CRH神经元全脑输入架构**

通过对连续冠状切片的系统分析，研究人员在端脑、间脑、中脑、脑桥和延髓中广泛检测到tdTomato标记的输入神经元，小脑未见标记。利用Circos图对55个解剖定义脑区的输入进行定量映射，结果显示输入神经元比例在间脑最高，其中内侧视前区（MPOA）和下丘脑外侧区（LH）贡献最为显著。端脑区域，特别是腹侧海马CA1区（vCA1）和外侧隔核（LSN），也是重要的输入来源。中脑、脑桥和延髓区域贡献的输入神经元相对较少。值得注意的是，发现PVN内部存在局部微环路，即PVN内的中间神经元或邻近非CRH神经元为PVN^CRH神经元提供单突触输入。

**3.3 PVN^CRH神经元全脑输入的偏侧性定量分析**

对输入神经元沿头尾轴的分布分析显示，两侧半球分布轮廓大致相似，标记输入神经元较大比例位于距前囟约+1.0至+2.3 mm范围内。总体上，61.4%±2.4%的标记输入神经元位于注射同侧，38.6%±2.4%位于对侧，表现出明显的同侧优势但保留了大量的跨半球神经支配。在端脑内，vCA1贡献了最大比例的同侧输入，LSN为第二大来源；在间脑内，LH和MPOA主导同侧和对侧输入。值得注意的是，对侧PVN也含有相当数量的标记神经元，表明两侧PVN^CRH神经元之间存在实质性的交互连接。根据输入占比，所有传入核团被分为四个等级：众多（>4%）、大量（2%-4%）、中等（1%-2%）和稀疏（<1%）。

**3.4 PVN^CRH神经元的输出投射概况**

顺行示踪结果显示EYFP标记的轴突末梢广泛分布于多个下游脑区。RNAscope-FISH分析确认71.5%的EYFP⁺神经元共表达Crh mRNA（n=144个细胞）。在排除PVN本身后，定量分析显示：在端脑，伏隔核核心（AcbC）接受最显著的神经支配（占2.6%±0.2%）；在间脑，LH是主要投射靶区，在所有定量核团中具有最高比例的轴突（13.2%±0.1%）；在中脑，中间层上丘（isRt）占据标记末梢的最大比例（5.6%±0.5%）；在脑桥，面神经核（7N）是主要投射靶点（1.2%±0.5%）；在延髓，孤束核（NTS）接受最密集的神经支配（10.7%±0.4%）。这些输出投射不仅覆盖调节先天和生理状态的下丘脑和脑干核团，还延伸至参与高级认知和情绪处理的端脑及中脑边缘系统环路。

**4 总结与讨论**

本研究通过结合Cre依赖型单突触狂犬病毒示踪与顺行AAV标记，成功构建了PVN^CRH神经元的全脑单突触输入-输出图谱，揭示了其复杂的连接架构。与既往研究相比，该图谱在细胞类型特异性、分辨率和定量分析方面取得了显著进展，确认了已知连接并发现了若干先前未被充分认识的通路，如来自vCA1和AcbC的直接输入。

**4.1 与既往连接组研究的比较及新环路的鉴定**

既往研究主要基于传统示踪剂，无法区分PVN内不同的神经元亚群。本研究利用Cre依赖技术实现了对CRH神经元的特异性标记。研究结果不仅证实了NTS作为上行儿茶酚胺能输入的重要来源，还新发现了vCA1和AcbC的直接输入。vCA1的输入提示海马可能通过直接单突触通路调节PVN^CRH神经元活动，而非仅仅经由BNST等间接中继。AcbC的直接输入则为奖赏相关信号直接影响HPA轴提供了解剖学基础。

**4.2 PVN^CRH神经元连接应激评估与HPA轴及情绪行为**

输入输出数据显示，PVN^CRH神经元嵌入一个广泛的端脑-下丘脑-脑干网络中。它们接受来自前边缘皮质（PrL）、LSN、BNST、中央杏仁核（CeA）、内侧杏仁核（MeA）和AcbC等情绪与认知相关脑区的密集单突触支配，并向BNST、CeA、MeA、AcbC以及腹侧被盖区（VTA）等区域发出投射。这种相互和前馈连接为PVN^CRH神经元在调节情绪效价、回避与趋近行为及奖赏处理中提供了解剖学基础，支持其作为整合应激评估环路与协调内分泌和情绪反应的枢纽。

**4.3 PVN^CRH神经元协调应激相关的自主神经、内脏及躯体反应**

在脑干水平，PVN^CRH神经元密集投射至参与心血管和呼吸控制的核团，包括NTS、外侧臂旁核（LPB）、延髓头端腹外侧区（RVLM）、延髓尾端腹外侧区（CVLM）以及前包钦格复合体和包钦格复合体等呼吸节律生成区。这些通路为应激诱导的心动过速、血压升高和呼吸模式改变提供了解剖基础。此外，投射至DMNV等的通路与应激相关的胃动力改变有关，而投射至自主神经和儿茶酚胺能核团的通路可能影响免疫炎症过程。输入定量分析显示约60%的输入位于同侧，这种偏侧但双侧组织的结构表明PVN^CRH神经元既能协调对称的自主神经输出，又能整合略不对称的前脑输入。

**4.4 研究局限性与结论**

本研究存在若干局限性。其一，RNAscope分析显示约82%-88%的报告基因阳性神经元共表达Crh mRNA，表明有少量（12%-18%）标记细胞可能并非CRH神经元，这与CRH-IRES-Cre品系的既往特征描述一致。其二，研究仅在雄性小鼠中进行，结果应视为雄性特异性图谱。其三，Cre/loxP重组的不可逆性可能标记了历史上曾表达Crh的神经元。其四，解剖示踪和神经元数量不能直接等同于功能影响力，未考虑突触密度、强度和突触后位置等因素。

综上所述，本研究以细胞分辨率定义了PVN^CRH神经元的全脑输入-输出架构，证明其位于边缘系统应激评估环路、下丘脑内部状态中枢和脑干自主神经及呼吸核团的交汇点。该组织结构支持将PVN^CRH神经元视为不仅是HPA轴的发起者，更是连接心理和情境信息与协调的内分泌、情绪和自主神经反应的核心节点。这一连接组框架为未来研究功能失调的PVN^CRH活性如何导致应激相关精神及心肺代谢疾病提供了结构基础。

**研究结论** 通过结合单突触狂犬病毒示踪与Cre依赖型顺行标记，本研究在细胞分辨率下定义了PVN^CRH神经元的全脑输入-输出架构。除了记录广泛的连接性外，数据表明PVN^CRH神经元位于边缘系统应激评估环路、下丘脑内部状态中枢和脑干自主神经及呼吸核团的交汇点。这种组织支持将PVN^CRH神经元不仅视为HPA轴的下丘脑起源，而且视为将心理和情境信息与协调的内分泌、情绪和自主神经反应联系起来的中枢节点。此处提供的连接组框架为未来在环路水平研究功能失调的PVN^CRH活性如何促成应激相关精神疾病和心肺代谢疾病奠定结构基础。