Midkine与CA9是三阴性乳腺肿瘤中潜在的癌症干细胞生物标志物

《Analytical Cellular Pathology》：Midkine and CA9 Are Potential Cancer Stem Cell Biomarkers in Triple-Negative Breast Tumours

　　

摘要
背景：目前尚无针对三阴性乳腺癌（TNBC）的特异性疗法，且其复发率较高。癌症干细胞（CSCs）在肿瘤化疗耐药和转移中发挥重要作用，但此类肿瘤中缺乏共识性标志物。本研究旨在鉴定TNBC患者血浆分泌蛋白组中的CSC生物标志物。
方法：通过磁性免疫选择法从MDA-MB-436和MDA-MB-231（ATCC）细胞系中分离CD44⁺/CD24^? CSCs。采用尺寸排阻色谱法（SEC）从无胎牛血清（FBS）的条件培养基（CM）以及TNBC和健康女性的血浆中分离细胞外囊泡（EVs）。四旋蛋白CD9和CD81用于鉴定EVs，电子显微镜确定其形态，可调电阻脉冲传感（TRPS）确定颗粒尺寸。使用Luminex技术检测L1细胞黏附分子（L1CAM）、碳酸酐酶IX（CA9）、间皮素、midkine、肝素、激肽释放酶-6（KLK6）、转谷氨酰胺酶2（TGM2）、乙醛脱氢酶1a1（ALDH1A1）、上皮细胞黏附分子（EpCAM）和分化簇44（CD44）的存在。
结果：在CSC-MDA-MB-436中，0–200 nm粒径的颗粒更为常见，而CSC-MDA-MB-231中201–500 nm粒径的颗粒更为常见。在血浆中，TNBC患者的颗粒大小为150–250 nm，健康个体为150–300 nm。MDA-MB-231细胞系来源的CSCs（CSC-MDA-MB-231）颗粒浓度为1.3×10¹⁰，而MDA-MB-231细胞系（L-MDA-MB-231）为3.8×10⁷。MDA-MB-436中CSCs的浓度为2.7×10⁸，而L-MDA-MB-436为9.4×10⁷。Midkine和CA9存在于两种CSC系的EVs及TNBC女性血浆中，但在健康女性血浆中缺失。Midkine表现出更好的统计学区分度。
结论：EVs的大小和浓度具有异质性。Midkine和CA9由TNBC女性体内的CSCs产生，可能是此类肿瘤中CSCs的潜在生物标志物。

论文解读文章

一、研究背景与目的
三阴性乳腺癌（TNBC）不表达孕激素受体、雌激素受体和人表皮生长因子受体2（HER2），对初始化疗反应良好，但复发率高，且具有高度异质性和可塑性，导致治疗困难。已有研究表明，TNBC中存在具有CD44⁺/CD24^?免疫表型的癌症干细胞（CSCs）亚群，其数量较管腔型和HER2表型更多，并具备自我更新能力，与耐药、转移和肿瘤复发密切相关。然而，目前缺乏针对TNBC中CSCs的特异性共识标志物。细胞外囊泡（EVs）作为分泌蛋白组的重要组分，携带核酸、蛋白质和脂质等，参与细胞间通讯和肿瘤转移。因此，研究人员旨在通过分析TNBC患者血浆及两种TNBC细胞系来源的CSC分泌蛋白组，寻找能够特异反映CSCs存在的常见肿瘤相关分子，为靶向CSCs的个体化治疗提供生物标志物依据。

二、研究方法概述
研究人员利用MDA-MB-436和MDA-MB-231两种人TNBC细胞系（均为claudin-low转录亚型，来自ATCC），通过磁性免疫选择法（MiniMACS分离器）分离CD44⁺/CD24^? CSCs，并经流式细胞术验证纯度。收集无血清条件培养基（CM）和19例TNBC患者及12例健康女性的血浆样本（TNBC患者来自秘鲁国家肿瘤疾病研究所，均已签署知情同意）。采用尺寸排阻色谱（SEC）结合Amicon超滤离心管提取EVs，通过可调电阻脉冲传感（TRPS，qNano系统）分析颗粒大小和浓度，透射电子显微镜（TEM）观察形态，Western blot检测四旋蛋白CD9和CD81以鉴定EVs。使用Luminex xMAP技术（MAGPIX仪器）和Milliplex MAP人类循环肿瘤生物标志物试剂盒（Panel 4）检测10种癌症相关分子，包括L1CAM、CA9、间皮素、midkine、肝素、KLK6、TGM2、ALDH1A1、EpCAM和CD44。统计学分析采用GraphPad Prism 6，组间比较使用Mann–Whitney、Kruskal–Wallis和ANOVA检验，以p<0.05为显著。

三、研究结果
1. 分泌蛋白组的分离与表征
（1）血浆分泌蛋白组总蛋白：TNBC患者血浆分泌蛋白组总蛋白中位数为393 μg/mL，显著高于健康对照（223.7 μg/mL，p<0.01）。
（2）细胞系分泌蛋白组颗粒大小：MDA-MB-231分泌组平均粒径226 nm（浓度3.26×10⁷颗粒/mL），MDA-MB-436平均粒径258 nm（浓度1.29×10⁸颗粒/mL）；CSC-MDA-MB-231平均粒径250 nm（浓度1.30×10¹⁰颗粒/mL），CSC-MDA-MB-436平均粒径182 nm（浓度2.64×10⁸颗粒/mL）。
（3）细胞系与CSC之间颗粒大小差异：MDA-MB-231与其CSC之间颗粒直径无显著差异（p=0.1），而MDA-MB-436与其CSC之间存在显著差异（p<0.01）。粒径分布方面，MDA-MB-231和CSC-MDA-MB-231均以201–500 nm颗粒为主（分别为86%和97%），但CSC-MDA-MB-231颗粒浓度远高于其亲本系（13亿/mL vs 3800万/mL）。MDA-MB-436以201–500 nm为主（42%），而CSC-MDA-MB-436以0–200 nm为主（65%），且CSC浓度更高（2.71亿/mL vs 1.17亿/mL）。
（4）血浆分泌蛋白组颗粒大小：TNBC患者血浆EVs粒径为150–250 nm，健康个体为150–300 nm，组间差异显著（p<0.01）。
（5）形态学：TEM显示CSC来源的EVs呈球形，大小30–500 nm。
（6）身份鉴定：Western blot证实所有样本中均存在CD81（26 kDa）和CD9（27 kDa）EV标记物。
（7）癌症标志物鉴定：在10种标志物中，仅midkine和CA9在TNBC患者血浆中显著高于健康女性（p<0.05至p<0.001），且midkine的区分度优于CA9；其他标志物无显著差异或未呈现规律性。

2. 讨论与结论
研究人员指出，EVs的大小和浓度在CSC分泌蛋白组中呈现高度异质性，这可能反映CSCs的高迁移和群体生长能力。CSC-MDA-MB-231产生的EVs浓度极高（1.3×10¹⁰），提示其更强的细胞间通讯能力。Midkine和CA9在两种CSC细胞系及TNBC患者血浆中均存在，而在健康血浆中缺失，说明它们可能由CSCs特异性分泌。Midkine在CSC-MDA-MB-231中的平均浓度为1815.69 ng/mL，是患者血浆水平（7.75 ng/mL）的约200倍；CA9在CSC中为24.87 ng/mL，是血浆水平（1.73 ng/mL）的约3倍。已有研究报道midkine通过NF-κB通路促进乳腺癌增殖和迁移，并可诱导上皮-间质转化；CA9与肿瘤侵袭、干细胞样特性及耐药相关。本研究首次提出这两种分子可能由TNBC中的CSCs产生，并可作为该细胞亚群的潜在生物标志物。结论部分强调，CSC分泌蛋白组中EVs大小和浓度具有异质性；midkine和CA9存在于TNBC干细胞分泌组和患者血浆中，但不存在于健康女性血浆中，因此可能成为TNBC中CSCs的潜在生物标志物。未来需通过基因沉默等研究进一步证实CSCs对这两种分子的功能依赖性，并需扩大样本量以验证其临床价值。该研究论文发表于《Analytical Cellular Pathology》。