通过冷冻电镜（Cryo-EM）研究嗜热地杆菌（Geobacillus stearothermophilus）中L-赖氨酸6-脱氢酶底物识别的结构基础

《Journal of Structural Biology》：Structural basis for substrate recognition in l-lysine 6-dehydrogenase from Geobacillus stearothermophilus by Cryo-EM

　　

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  首次获得了细菌L-赖氨酸6-脱氢酶（LysDH）的冷冻电镜（cryo-EM）结构。
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  GstLysDH在NAD⁺结合时形成四聚体，并发生全局构象变化。
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  带电残基定向L-赖氨酸的ε-氨基，以实现对底物的特异性。
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  其氢转移机制与•

  这些结构为LysDH的工程改造和

  引言

  氨基酸是生命的基本分子，在蛋白质合成和氮代谢等代谢途径中发挥着关键作用。由于它们的重要性，相关研究涵盖了生物化学和医学等多个领域。氨基酸分析通常采用仪器方法和酶学方法。仪器方法包括高效液相色谱和电喷雾离子化串联质谱（Yoshida等人，2015；Shimbo等人，2009；Moore等人，1958）。而酶学方法则利用对单一氨基酸具有高选择性的酶，通过比色法、紫外-可见光谱或电化学技术检测反应产物（Kameya等人，2013；Matsuda和Asano，2010）。在酶学方法中，氧化酶和脱氢酶常被用于氨基酸的检测。通过自然筛选和酶工程已开发出高选择性的酶（Asano，2019；Matsui，2023）。包括氨基酸氧化还原酶在内的酶的选择性一直是科学研究的重点。

  L-赖氨酸脱氢酶是一种氨基酸脱氢酶，它利用NAD⁺作为辅酶催化L-赖氨酸脱氢酶：L-赖氨酸6-脱氢酶（LysDH；EC 1.4.1.18）。前者与其他氨基酸脱氢酶类似，催化L-赖氨酸侧链上的ε-氨基的氧化脱氨，生成L-2-氨基己二酸6-半醛（Misono和Nagasaki，1982；Ruldeekulthamrong等人，2008；Heydari等人，2004）。这种物质可分子内环化生成Δ1-哌啶-6-羧酸（P6C），这是药物中间体L-pipecolic酸（L-PA）的前体。因此，LysDH可能是开发L-PA新合成路线的有用靶点（Pérez-García等人，2017；Pérez-García等人，2016；Pauli等人，2023）。

  LysDH最初在Agrobacterium tumefaciens中被发现，是参与L-赖氨酸的高度选择性，该酶也被用于生物样本中L-赖氨酸和NAD⁺的K_m值分别为0.73和0.088?mM。它对d-赖氨酸或其他氨基酸无识别能力。GstLysDH在60 °C时仍保持高选择性和稳定性，因此在工业应用（包括酶法）中非常有用。

  关于LysDH的结构，2010年报道了来自古菌Pyrococcus horikoshii的LysDH（PhoLysDH）与其辅酶NAD⁺的复合结构（Yoneda等人，2010）；PhoLysDH与GstLysDH有33%的序列一致性。相比之下，尽管对细菌来源的LysDH的酶学性质进行了广泛研究，但迄今为止尚未对其结构或催化机制有详细报道。此外，虽然PhoLysDH的多聚态是二聚体，但GstLysDH的多聚态为六聚体（Heydari等人，2004；Yoneda等人，2010）。有趣的是，不同物种之间的多聚态形式存在差异。在本研究中，使用单颗粒冷冻电镜（Cryo-EM）对GstLysDH进行了观察。GstLysDH的apo形式以及与辅酶NAD⁺和底物

  章节摘录

  蛋白质表达与纯化

  GstLysDH的序列（Uniprot: Q9AJC6）经过密码子优化后适用于大肠杆菌，并通过基因合成获得（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）。该DNA片段被克隆到用NdeI和BamHI限制性内切酶切割的pET-16b载体中（使用GeneArt Enzyme mix试剂盒，Thermo Fisher Scientific）。质粒被转入E. coli BL21（DE3）菌株，并在含有100?μg/mL氨苄西林的LB培养基中于37?°C下培养。当OD₆₀₀达到0.6时，开始蛋白质表达

  LysDH的总体结构

  为了确定GstLysDH的结构，首先在E. coli中表达该蛋白，然后通过三步柱层析法纯化，并通过冷冻电镜（cryo-EM）进行分析。apo形式的分辨率达到2.9??，而与NAD⁺和

  结论

  在本研究中，我们对来自嗜热细菌Geobacillus stearothermophilus

  的L-赖氨酸的复合物结构（2.5??分辨率）。这些结构是首次揭示的细菌LysDH结构，扩展了我们对LysDH寡聚体组装的理解。

  CRediT作者贡献声明

  Toshiya Funahashi:撰写——初稿；撰写——审稿与编辑；实验研究；数据分析；数据管理；验证；可视化。Hiroki Yamaguchi:撰写——审稿与编辑；实验研究；数据分析；概念化。Shota Suzuki:撰写——审稿与编辑；实验研究；数据分析；数据管理。Hiroshi Suzuki:撰写——审稿与编辑；实验研究；数据分析。Kouki Nishikawa:实验研究。Kazutoshi Takahashi:

  伦理声明

  本文符合伦理标准。作者们未参与任何涉及人类或动物的研究。

  资助

  本研究得到了日本医学研究与发展机构（AMED）的资助，资助编号包括JP21fk0108462、JP21fk0108585、JP21ae0121028和JP18ae0101046（YF）。此外，该研究还得到了日本学术振兴会（JSPS）KAKENHI项目的部分支持（20H00451（YF），JP24K18061（SS）。

  利益冲突声明

  作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

  致谢

  本研究得到了Ajinomoto Co.公司的支持。我们感谢Yuriko Yoshida和Seitaro Tsutsumi在他们技术上的协助。

  Toshiya Funahashi|Hiroki Yamaguchi|Shota Suzuki|Hiroshi Suzuki|Kouki Nishikawa|Kazutoshi Takahashi|Moemi Tatsumi|Toshimi Mizukoshi|Hiroshi Miyano|Yoshinori Fujiyoshi|Masayuki Sugiki