《Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition》：A Year in the Bones: Investigating Bone Resorption Across a Reproductive Year in Wild Female Assamese Macaques
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摘要
生殖活动对雌性个体施加了相当大的代谢需求，尤其在妊娠和哺乳期间，此时钙稳态和骨代谢面临挑战。尿I型胶原C端交联肽（CTX-I）提供了一种有用的非侵入性标记物来评估骨吸收。研究人员测定了生活在泰国Phu Khieo野生动物保护区的野生阿萨姆猕猴（*Mac
摘要
生殖活动对雌性个体施加了相当大的代谢需求，尤其在妊娠和哺乳期间，此时钙稳态和骨代谢面临挑战。尿I型胶原C端交联肽（CTX-I）提供了一种有用的非侵入性标记物来评估骨吸收。研究人员测定了生活在泰国Phu Khieo野生动物保护区的野生阿萨姆猕猴（*Macaca assamensis*）的尿CTX-I水平。研究人员于2017年6月至2019年1月间从19只成年雌性个体收集了共663份尿液样本，并使用CTX-I酶联免疫吸附测定（ELISA）进行分析。广义加性模型揭示了距受孕天数与尿CTX-I水平之间的非线性关系，受孕前和分娩后水平较高，而妊娠期间水平较低。然而，当排除上一年泌乳的雌性个体（19只中的6只）后，这一模式仍然存在，进一步分析表明，是季节性而非生殖周期最能解释尿CTX-I水平的变化。CTX-I水平呈现两个年度峰值，主要峰值出现在雨季末期（8月至9月）。尿液浓度的季节性变化并不能解释这一模式。这些发现表明，在该阿萨姆猕猴研究种群中，骨吸收随季节变化，可能是对环境或内分泌周期的响应，而非主要由生殖的代谢需求驱动。
论文解读：野生雌性阿萨姆猕猴生殖年度中的骨吸收季节变化研究
一、研究背景与科学问题
雌性哺乳动物在生殖过程中，尤其是妊娠和哺乳阶段，面临显著的代谢负担，钙稳态和骨代谢受到严峻挑战。骨骼作为体内钙和磷等必需矿物质的主要储存库（约99%的体内钙储存于骨骼），在维持全身矿物质稳态中发挥关键作用。妊娠期间，增高的钙需求主要通过母体增强肠道钙吸收来满足，骨骼贡献相对有限；而哺乳期间，钙则主要通过破骨细胞介导的骨吸收和骨细胞性骨溶解从母体骨骼中调动。骨吸收可通过反映骨基质降解产物的生化标记物进行量化，其中尿I型胶原C端交联肽（CTX-I）是临床应用和研究中最广泛的标记物之一。CTX-I是I型胶原降解过程中产生的片段（I型胶原占有机骨基质90%以上），以与破骨细胞介导的胶原降解成比例的方式释放入血，经肾脏代谢排泄，可在血液和尿液中检测。尿CTX-I作为一种非侵入性标记物，在血液采集受后勤或伦理限制的场景中尤为有价值。
在人类和家养哺乳动物（如奶牛、猪、山羊、绵羊）中的研究一致显示，妊娠期间母体骨吸收增强，CTX-I水平随妊娠进展而升高，哺乳期仍维持高水平。然而，最近一项关于野生倭黑猩猩（*Pan paniscus*）的研究发现，妊娠期尿CTX-I水平高于哺乳期，且哺乳早期CTX-I水平在所有生殖状态中最低，这与哺乳普遍增加骨吸收的预期相悖，提示野生灵长类可能存在物种特异性的骨代谢生殖调控模式，需要结合生态和物种特异性因素进行解读。
阿萨姆猕猴（*Macaca assamensis*）是季节性繁殖动物，在Phu Khieo野生动物保护区（PKWS）的野生种群中，受孕集中于交配季节，约80%的出生发生在4月至6月的3个月窗口内，平均妊娠期为165天。多数雌性可在约1年内完成妊娠、哺乳和断奶的完整生殖周期，约三分之一的产仔间隔接近1年，这意味着雌性可能在一年内经历连续妊娠和哺乳，缺乏骨骼恢复的机会。鉴于该物种明确的季节性繁殖和快速生殖周转特征，研究其骨吸收模式是否更接近家养物种还是自由放养类人猿，具有重要的比较生理学意义。
基于人类和家养哺乳动物的既往发现，研究人员预测尿CTX-I水平在妊娠期间逐渐升高并在哺乳早期达到峰值；或者，如果野生倭黑猩猩的模式（哺乳早期CTX-I水平低于妊娠期）代表了面临自然环境约束的非人灵长类的普遍模式，则预测分娩后CTX-I水平下降，随后随哺乳进展逐渐升高。
二、研究方法概述
本研究依托泰国东北部PKWS（约6500 km2保护林区，海拔600–800米，以常绿丘陵森林为主）的长期监测项目。研究人员于2017年6月至2019年1月间，从19只成年雌性阿萨姆猕猴中机会性采集了663份无粪便污染的尿液样本。所有采集程序均为非侵入性，已获得泰国相关部门许可。尿CTX-I浓度采用市售三明治酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Urine BETA CrossLaps [CTX-I], REF AC-05F1, Immunodiagnostic Systems）测定，通过系列稀释验证了该测定在阿萨姆猕猴尿液中的适用性并确定最佳稀释度为1:5。数据统计分析使用R软件，采用广义加性模型（GAM），纳入受孕相对天数、采样时间、哺乳状态的固定效应和个体随机截距，并通过后验模型比较生殖效应与季节效应（日序，DOY）的解释力。
三、主要研究结果
3.1 受孕相对天数与尿CTX-I水平的非线性关系
基于含19只雌性的完整数据集（k=37）的GAM分析显示，受孕相对天数的平滑项显著预测尿CTX-I水平（edf=9.713，F=5.72，p<0.001），模型解释了24.9%的偏差（调整R2=0.22）。尿CTX-I水平在受孕前（约受孕前162至81天）和分娩后（哺乳期）较高，妊娠期较低。时间效应显著（β=?0.423，SE=0.076，p<0.001），表明尿CTX-I水平随时间推移呈下降趋势。哺乳状态不是显著预测因子（β=0.017，SE=0.159，p=0.913），怀孕前观察到的CTX-I升高不能归因于先前哺乳。
3.2 排除前一年泌乳雌性的敏感性分析
为排除受孕前CTX-I水平升高是由2017年产仔的6只雌性哺乳驱动的可能性，研究人员对仅包含13只未在2017年产仔的雌性的子数据集（k=9）重复了GAM分析。结果表明，受孕前CTX-I高水平并随时间下降的模式在排除哺乳个体后依然存在，受孕前CTX-I高峰并非仅仅是少数雌性泌乳所致。
3.3 季节效应与生殖效应的分离
由于受孕相对天数与日序之间存在高度非线性共曲性（观察共曲性>0.9），研究人员拟合了包含两个平滑项的组合模型。结果显示，仅日序平滑项显著预测尿CTX-I水平（表3），受孕相对天数的效应不再显著。包含两者交互项未能显著改善模型拟合，表明生殖时间尺度的效应实际上可由季节性变化所解释。
3.4 季节性变化模式与排除尿液浓度混杂
仅含日序的季节性模型（k=47）解释了30.1%的偏差（调整R2=0.25）。尿CTX-I水平呈现两个年度峰值：一个较小的峰值在2月左右，一个主要峰值在8月至9月（雨季末期）。将比重的预测季节变化作为协变量纳入模型后，季节平滑效应并未受显著影响（残差比重：β=?7.53，SE=16.07，p=0.639），表明尿CTX-I的季节性变化并非由尿液浓度的季节变化所驱动。
3.5 昼夜节律与个体差异
尿CTX-I水平在一天中表现出显著下降趋势，证实了阿萨姆猕猴存在骨吸收的昼夜节律。随机截距显著（edf=13.174，F=2.918，p<0.001），且纳入随机截距显著改善模型拟合，表明个体间存在显著的骨吸收水平差异，与生殖状态无关。
四、讨论与结论
本研究表明，从受孕事件发生的时间点来看，阿萨姆猕猴雌性尿CTX-I水平在妊娠期保持相对较低，妊娠中期出现一个较小的峰值，分娩后急剧上升，并在哺乳第3个月达到绝对峰值。受孕前3个月的CTX-I峰值不能归因于前一年后代的哺乳，因为排除前年产仔雌性后该模式依然存在。后验分析表明，观察到的骨吸收变异可能反映了一种季节性生理节律，而不是主要由生殖生命史各阶段的钙需求变化驱动。
在讨论部分，研究人员提出以下潜在解释：（1）内分泌季节性：阿萨姆猕猴作为季节性繁殖者，交配季节前雌激素和孕激素水平均较低，雌激素抑制骨吸收的作用减弱导致破骨细胞活性增加，孕激素对成骨细胞刺激作用降低，可能共同促进骨吸收增强。然而，代谢激素（如三碘甲状腺原氨酸T3和皮质醇）在同期从妊娠晚期到哺乳早期的下降趋势与观察到的分娩后CTX-I升高方向不符，因此不太可能是驱动因素。（2）生态因素：雨季（4月至10月）长期云层覆盖可能减少紫外线B（UV-B）暴露，影响皮肤中维生素D的合成，导致维生素D储备逐渐耗竭，肠道钙吸收降低，从而代偿性增强骨吸收，这可能解释了雨季末期（8月至10月）观察到的CTX-I高水平。（3）昼夜节律和个体差异是骨吸收调控中的额外影响因素，提示采样时间需标准化，个体差异需通过重复采样和随机效应加以控制。
研究结论指出，野生雌性阿萨姆猕猴的尿CTX-I水平在一年中呈现的季节性变化模式，受季节影响大于妊娠和哺乳的影响。纵向采样揭示了尿CTX-I水平的季节性峰值，峰值的季节时相提示环境或内分泌周期的影响，而非单纯生殖钙需求。通过证明尿CTX-I可在野生灵长类中通过非侵入性手段可靠测定并用于长期监测骨吸收，本研究为未来探讨骨代谢如何受生态和生理因素在年周期中调控的研究提供了方法论框架，对理解野生灵长类生殖生理与骨骼健康具有重要意义。该论文发表于《Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition》。
