海洋天然气油化学增强水容纳组分对Calanus finmarchicus的亚致死效应

《Marine Environmental Research》：Sub-lethal effects of Chemically Enhanced Water Accommodated Fraction from Marine Gas Oil on Calanus finmarchicus

　　

摘要
海洋天然气油（MGO）的日常使用日益增加，其在运输、使用和处置过程中发生海洋溢油的风险也随之上升，对开阔海洋和沿海环境构成威胁。化学消油剂是溢油修复的标准方法之一，其作用是分解海面浮油。尽管已有研究通过水容纳组分（WAF）考察了MGO的毒性，但关于商业消油剂产生的化学增强水容纳组分（CE-WAF）在寒冷环境中如何改变对海洋生物的毒性，相关研究仍然很少。桡足类Calanus finmarchicus是北大西洋浮游动物群落的重要组成，也是多种重要商业鱼类的重要食物来源。C. finmarchicus已被广泛用于碳氢化合物污染研究，因此是考察MGO的CE-WAF相关环境效应的适宜生物。为此，本研究旨在探究经消油剂FinaSol OSR52（油质量的10%）处理的MGO对C. finmarchicus防御组（defensome）的亚致死效应。在静态条件下，将成年C. finmarchicus暴露于亚致死浓度（相当于96小时急性LC₅₀值的一半）的CE-WAF中，持续24、48、72和96小时。通过观察选定生物标志基因的转录模式、氧化应激生物标志酶的活性、脂质过氧化水平以及游离态类胡萝卜素虾青素的积累来考察亚致死效应。基因转录分析显示，与对照组相比，所有暴露组中生物转化基因cyp 330A1均显著下调；延长酶（elongase）、脂肪酸结合蛋白和铁蛋白等基因转录水平的变化表明，CE-WAF暴露影响了脂质代谢，进而可能削弱桡足类的能量储存能力。过氧化氢酶（Catalase）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）和总谷胱甘肽（total glutathione）等氧化应激生物标志酶活性的显著降低，表明CE-WAF暴露诱导了氧化应激，其机制可能是消耗或抑制了抗氧化防御系统。然而，暴露组与对照组之间在脂质过氧化方面未观察到显著差异。最后，24小时暴露影响了游离态虾青素的浓度，表明暴露影响了桡足类体内虾青素的利用动态。

论文解读

一、研究背景与问题

近年来，国际海事领域对船舶燃料硫含量实施了严格限排法规，加之北极水域对重燃料油（Heavy Fuel Oil）使用的普遍禁令，船舶行业逐渐转向低硫替代燃料。海洋天然气油（Marine Gas Oil, MGO）作为一种轻质馏分混合燃料，因硫含量低（低于0.1%）、二氧化碳和氮氧化物排放较少，成为大型船舶和邮轮的重要替代能源。同时，小型休闲游艇对MGO的需求也在持续增长，欧洲水上旅游年收入超过230亿欧元。然而，MGO的运输、使用及处置过程中发生意外泄漏的风险随之上升，港口、码头和海上航线面临日益严峻的溢油威胁。溢油进入海洋后，受风化过程影响，水溶性化合物会溶解形成水容纳组分（Water Accommodated Fraction, WAF），其中包含脂肪族化合物和多环芳烃（PAHs），这些可生物利用的组分是造成海洋生物毒性的主要来源。化学消油剂是常用的溢油修复手段，通过降低界面张力将浮油分散为微小液滴进入水柱，从而减少油污向海岸带的扩散。消油剂与油混合形成的化学增强水容纳组分（Chemically Enhanced WAF, CE-WAF）已被证明对多种海洋生物具有毒性。然而，现有研究多集中于轻质原油的CE-WAF，对燃料油尤其是船用MGO的CE-WAF在寒冷环境中的毒性效应知之甚少。随着北极/亚北极地区冰层覆盖减少、新航线开辟和油气开采活动增加，该区域生态系统面临溢油风险的持续上升。桡足类Calanus finmarchicus是北大西洋浮游动物生物量的重要组成部分，占浮游动物生物量的一半以上，是多种商业鱼类的主要食物来源，在食物网能量流动中起关键作用。该物种已被广泛用于油污染毒理学研究，且其虾青素和蜡酯等成分具有日益增长的商业价值。然而，迄今尚无研究在分子水平考察MGO的CE-WAF对C. finmarchicus的影响。因此，本研究旨在模拟溢油修复后CE-WAF对海洋生物的环境效应，从基因转录、酶活性、脂质过氧化和虾青素动态等多方面揭示其亚致死毒性机制。

二、主要技术方法

本研究采用多生物标志物综合策略。CE-WAF依据CROSERF指南制备，将MGO与过滤海水按1:40（v:w）混合，并按1:10消油剂比加入FinaSol OSR52，持续搅拌72小时并静置1小时。PAHs组成通过气相色谱-低分辨质谱（GC-MS）结合搅拌棒吸附萃取测定。实验所用C. finmarchicus雌体取自挪威科技大学Sealab连续培养系统。先进行96小时急性毒性实验确定LC₅₀，据此选择50% LC₅₀（4.12% CE-WAF）作为亚致死暴露浓度。暴露实验在5 L密闭玻璃瓶中进行，每个取样时间点（0、24、48、72、96 h）设置5个重复瓶，每瓶含40只雌体。基因转录分析采用RT-qPCR，选取生物转化、抗氧化、分子伴侣和脂质代谢相关基因，以elongation factor 1 alpha为内参基因，用Pfaffl法计算相对表达量。酶活性分析包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、总谷胱甘肽（tGSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、氧自由基吸收能力（ORAC）以及脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的测定。游离态虾青素采用反相高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）定量，并利用高分辨质谱（Q Exactive Focus Orbitrap）鉴定虾青素的酯化形式。

三、研究结果

（1）化学分析：未稀释CE-WAF中总PAHs浓度为2386 μg/L，4.12%暴露液中总PAHs名义浓度为98.30 μg/L。低分子量PAHs（少于2环）占总PAHs的99%以上，其中苊（acenaphthene）浓度最高（1114 μg/L），其次为萘（naphthalene，797 μg/L）和芴（fluorene，302 μg/L）。高分子量PAHs中菲（phenanthrene）浓度最高（5.89 μg/L）。

（2）急性毒性：CE-WAF即使在低浓度下也对C. finmarchicus具有毒性，且死亡率呈时间依赖性。24、48、72和96小时的LC₅₀分别为22%、14.2%、10%和8.22% CE-WAF。据此选择4.11% CE-WAF（96小时LC₅₀的50%）作为亚致死暴露浓度。

（3）生物标志基因转录水平：生物转化基因cyp330a1在所有暴露组中较对照组显著下调。抗氧化基因cat在48小时暴露组和72小时对照组较0小时显著下调；gst III在48/96小时暴露组和对照组均较0小时显著下调；sod无显著变化。热休克蛋白基因hsp70和hsp90在各组间无显著差异。脂质代谢基因中，elov在48、72、96小时的暴露组和对照组均较0小时显著下调，且48小时暴露组与对照组间有显著差异；fabp在24小时暴露组较0小时及72、96小时暴露组显著下调；fer在48、72、96小时暴露组较各自对照组显著上调，且96小时暴露组较24和48小时暴露组显著上调。

（4）酶活性、ORAC、tGSH、tGSH/GSSG及脂质过氧化：SOD活性在24、48、96小时暴露组较各自对照组显著降低。CAT活性在暴露组和对照组中均较0小时显著降低，且48小时与96小时暴露组间存在显著差异。GST活性在对照组与暴露组间无显著差异。ORAC在48小时暴露组显著低于96小时对照组，且96小时暴露组显著低于24、48小时暴露组及0小时取样。tGSH水平在所有暴露组中较各自对照组和0小时取样显著降低，24小时对照组也显著低于0小时。tGSH/GSSG比值在24小时暴露组显著高于0小时和96小时暴露组。MDA浓度在各实验组间无显著差异。

（5）游离态虾青素含量：在色谱图中观察到单酯和双酯形式的虾青素峰，经高分辨质谱确认了游离态虾青素及C16、两个C18和一个C20单酯的存在。24小时暴露组的游离态虾青素浓度显著低于对照组，而24小时对照组较0小时取样显著升高。

四、讨论与结论

本研究表明，MGO的CE-WAF在低至4.12%的浓度下即可对C. finmarchicus产生亚致死毒性。cyp330a1的显著下调与已有研究一致，但本研究中萘暴露浓度（796 μg/L）低于先前报道中引起相同效应的浓度（2500 μg/L），提示CE-WAF中其他组分或消油剂可能增强了毒性。cyp330a1参与蜕皮激素的羟基化，其下调可能影响桡足类的发育和繁殖。elov、fabp和fer基因的时间依赖性表达模式与Tarrant等提出的C5期桡足类进入滞育时的表达途径相似，提示CE-WAF暴露可能改变脂质代谢，模拟滞育启动条件。酶活性结果显示，96小时暴露组SOD、CAT、ORAC、tGSH活性及tGSH/GSSG比值均较低，表明氧化损伤效应在96小时最为显著。tGSH的降低可能与消油剂抑制GSH合成或促进PAHs与GSH结合排泄有关，但本研究未观察到GST活性升高，消油剂的单独作用仍需进一步研究。尽管转录水平和酶活性提示存在氧化应激，但未观察到显著的脂质过氧化，这可能是由于游离态虾青素的保护作用。24小时暴露组游离态虾青素浓度显著低于对照组，且对照组在24小时出现虾青素升高，这可能与饥饿诱导的酯化虾青素降解有关，而暴露组虾青素动态被扰乱，表明CE-WAF干扰了虾青素代谢的反馈机制。虾青素在保护细胞膜免受磷脂过氧化损伤、维持脂质代谢和生殖能力方面具有重要作用，其动态紊乱可能造成不良后果。综上，MGO的CE-WAF从氧化应激、脂质代谢和虾青素利用等多个分子层面影响C. finmarchicus，提示在频繁航运区域，商业船只泄漏精炼燃料对北大西洋浮游动物群落构成持续风险。因此，有必要根据化学消油剂对海洋生物的潜在风险重新评估其在海洋环境中的应用。