基于磁性纳米酶和纳米通道电极的比率型比色-电化学双模式传感用于海水中硝酸盐和亚硝酸盐的测定

《Microchemical Journal》：Ratiometric colorimetric-electrochemical dual-mode sensing using magnetic nanozyme and nanochannel electrode for nitrate and nitrite determination in seawater

　　

•结合了磁性纳米酶和纳米通道电极的催化放大作用。
•建立了比率比色 - 电化学双模态传感平台。
•纳米通道电极通过探针富集放大信号并改善了抗污性能。
•通过调节探针浓度可调整亚硝酸盐检测窗口。
•实现了海水中的直接亚硝酸盐和间接硝酸盐传感。

引言
亚硝酸盐（NO2?）和硝酸盐（NO3?）是海洋氮循环中两种主要的无机氮形态，在海洋生态系统的物质周转和能量流动中发挥着重要作用 [1]。NO2?和 NO3?水平的变化不仅反映了海水中的氮转化过程，还与富营养化和生态系统状况密切相关 [2]。NO2?因其生物毒性和潜在致癌性而备受关注，而 NO3?是浮游植物和藻类的重要营养来源，其过度积累可能促进藻类爆发及相关环境问题 [3]。因此，开发快速、灵敏和准确的 NO2?和 NO3?测定方法对于海洋环境监测、生态风险评估和水质监控具有重要意义。

各种分析技术已被用于 NO2?和 NO3?的测定，包括比色法 [4]、离子色谱法 [5]、电化学分析 [6] 和荧光方法 [7]。比色法因其操作简便和成本低廉而颇具吸引力，但在复杂的海水基质中容易受到共存离子、有机物和浊度的干扰。离子色谱法具有良好的分离效率和定量能力，但通常依赖相对昂贵的仪器和繁琐的样品制备。基于荧光的方法可以提供高灵敏度。然而，其性能往往受到背景荧光的限制。电化学技术因其高灵敏度、快速响应和仪器便携性而受到广泛关注，但通常缺乏直观的视觉读数。因此，单一的传感模式无法结合高灵敏度、分析可靠性和直观的信号输出 [8], [9], [10]。双模态传感的最新进展表明，耦合两条独立的转导通路可以提高分析可靠性，拓宽可用浓度范围，并实现结果的交叉验证，特别是在复杂基质中 [11], [12]。代表性平台集成了比色、荧光、电化学和其他信号输出，结合了光学读数的直观优势与互补分析方法的高灵敏度 [13], [14]。这些进展为构建环境分析的多模态方法提供了有希望的基础 [15], [16]。

3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）是比色分析、生物传感和酶催化分析中常用的底物 [17], [18], [19]。氧化后，TMB 转化为氧化型 TMB（oxTMB，也称为 TMB+），在可见光区域表现出特征吸收（652 nm 处的特征吸光度，A652），从而产生明显的颜色变化 [20], [21]。同时，TMB/oxTMB 对表现出可逆的氧化还原行为，并能在电极界面产生稳定的电化学响应。由于其固有的双输出特性，TMB 非常适合作为构建比色 - 电化学双模态传感系统的信号分子 [22]。与单模态方法相比，双模态传感可以通过两条独立的信号生成途径提供验证，从而降低假阳性或假阴性的结果 [23]。更重要的是，与传统的单波长比色分析不同，比率比色记录两个特征波长处的变化，并将它们的比值作为分析参数 [24], [25]。这种信号格式可以有效减少光源波动、探针浓度变化、环境扰动和样品背景吸收的影响，从而提高分析准确性和抗干扰容限。因此，基于 TMB 的比率比色 - 电化学双模态平台具有无机氮测定的潜力。

对于电化学信号读出，虽然 oxTMB 具有电化学活性，但其在常规电极上的响应可能仍然受到信号有限、选择性不足以及复杂基质中潜在干扰的影响。例如，在实际样品分析中，电极表面通常会被吸附的杂质、反应副产物或大分子物质污染，这可能导致界面钝化和重现性差 [26], [27], [28]。垂直有序介孔二氧化硅纳米通道膜（SNF）具有高度均匀的孔径和垂直纳米通道，使其成为电极修饰的一种有吸引力的纳米受限界面 [29], [30], [31], [32]。一方面，SNF 带负电的纳米通道有利于带正电的氧化还原探针的富集，从而增强其电化学响应 [33], [34]。另一方面，纳米通道阵列可以阻碍颗粒、大分子和一些干扰物质接近电极表面，减少非特异性吸附和表面污染，同时保持界面活性 [35], [36], [37], [38]。因此，SNF 修饰的电极有望提高比色 - 电化学双模态传感系统的灵敏度、选择性和抗干扰能力。

对于 NO2?分析，之前的研究表明 NO2?可以与 oxTMB 反应，在 652 和 445 nm 处产生相反的吸光度变化，这一特征已被用于构建灵敏的比率比色方法 [39]。然而，在实际传感系统中，探针浓度是影响分析性能的关键因素。有报道指出，探针浓度的变化会显著影响线性范围、灵敏度和检测限 [40]。在 TMB-H2O2 体系中，TMB 的浓度不仅决定了生成的 oxTMB 的量，还直接影响比色信号的强度和电化学响应的大小，从而影响传感性能。因此，合理调节 TMB 的量可能提供一种有效手段，使平台适应不同浓度水平的 NO2?样品。与 NO2?相比，NO3?不易与氧化型 TMB 反应，因此通常需要在分析前转化为 NO2?。在目前的预还原方法中，镉还原柱因其相对较高的还原效率而被广泛用于间接 NO3?测定。因此，将镉柱预处理与基于 TMB 的双模态传感系统耦合，为高效的 NO3?-to-NO2?转化及后续信号输出提供了一条可行途径，实现了间接 NO3?分析。

改进 TMB-H2O2 系统的另一个关键策略是引入具有过氧化物酶（POD）样活性的纳米酶。纳米酶可以催化 H2O2 分解产生更多的活性氧（ROS），从而加速 TMB 氧化，增加 oxTMB 的产生，最终放大光学信号 [41], [42]。同时，oxTMB 水平的增加也可以导致电化学输出的同步增强。与自然酶相比，纳米酶通常具有制备简便、成本低、稳定性高和易于调节等优点 [43], [44]。磁性纳米酶尤其具有吸引力，因为它们结合了酶模拟催化和磁性响应，从而有助于 TMB-H2O2 系统的催化放大，并允许在传感过程中方便地进行磁性分离 [45], [46]。Co 掺杂 Fe3O4（Co-Fe3O4）作为一种纳米酶引起了广泛关注，原因如下。首先，Fe3O4 具有基于 Fe2+/Fe3+ 氧化还原循环的固有类 Fenton 活性，并且可以方便地通过磁分离收集。其次，由于 Co2+ 的离子半径与 Fe2+ 相当，Co 物种可以掺入尖晶石晶格，调节 Fe3O4 的局部配位环境和电子结构。第三，Co2+/Co3+ 和 Fe2+/Fe3+ 氧化还原对的耦合，加上氧空位的引入，可以促进 H2O2 吸附、界面电子转移和活性氧产生。因此，预计 Co 掺杂可以增强 Fe3O4 的 POD 样活性，同时保持其磁性处理能力。

在本工作中，开发了一种比率比色 - 电化学双模态传感方法用于海水中 NO2?和 NO3?的测定，该方法使用 Co-Fe3O4 磁性纳米酶作为催化放大材料，TMB 作为双响应探针，SNF 修饰电极用于高效的 oxTMB 电化学读出，以及镉还原柱用于 NO3?预处理。具体而言，Co-Fe3O4 纳米酶放大了 TMB-H2O2 体系的响应，SNF 纳米通道界面增强了 oxTMB 的电化学读出同时提高了电极的抗污能力，调节 TMB 浓度拓宽了 NO2?分析的适用浓度窗口。借助镉柱还原，NO3?被高效转化为 NO2?，实现了对 NO2?和 NO3?的灵敏测定。通过整合比率比色与电化学转导，所提出的平台为海洋环境中无机氮形态的快速监测提供了一种新策略，并进一步将双模态传感系统的应用扩展到复杂基质。

片段
Co-Fe3O4 的制备和纳米酶活性评价
Co-Fe3O4 磁性纳米酶通过溶剂热法合成 [47]。简而言之，使用总质量为 1.0 g、不同质量比的 FeCl3 和 CoCl2·6H2O 作为金属前驱体。前驱体溶解在 EG（20 mL）中，然后加入 NaAc（3.0 g）和乙二胺（EDA, 10 mL）。溶剂热过程在 200 °C 下进行了 8 h。产物通过磁分离收集，用超纯水和乙醇彻底洗涤，并在 60 °C 下干燥得到 Co-Fe3O4。

双模态检测的传感器设计和原理
通过整合 Co-Fe3O4 磁性纳米酶的催化放大与 SNF 修饰电极的电化学信号读出，构建了一个比率比色 - 电化学双模态传感平台，用于 NO2?和 NO3?的测定（图 1）。在该系统中，Co-Fe3O4 充当 POD 样催化材料，促进 H2O2 产生 ROS，从而将无色的 TMB 氧化成电化学活性的 oxTMB，其特征吸收峰中心位于 652 nm。该

结论
总之，通过整合 Co-Fe3O4 磁性纳米酶的催化放大与使用 SNF 修饰电极的电化学信号读出，开发了一种比率比色 - 电化学双模态传感平台。Co-Fe3O4 纳米酶催化了 H2O2 介导的无色 TMB 到 oxTMB 的氧化，后者表现出明显的光学和电化学响应。oxTMB 与 NO2?的反应导致吸光度比和

CRediT 作者贡献声明
赵静文：写作 – 初稿，调查，数据整理。李承伟：写作 – 初稿，调查，数据整理。李德旺：写作 – 回顾与编辑，验证，调查。刘继阳：写作 – 回顾与编辑，监督，资助获取，概念化。

竞争利益声明
作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这可能影响本文报告的工作。

致谢
我们感谢浙江省“尖兵”和“领雁”研发攻关计划（2024C03034）、浙江省自然科学基金（LQK26D060005）、自然资源部第二海洋研究所科研基金（SZ2404-4）以及国家自然科学基金（22374131 和 32201069）的财政支持。

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