背景：衰老是一个多因素过程，其特征是细胞调控逐渐失调，受基因组不稳定性、线粒体失调和慢性炎症等标志性特征调控。细胞外囊泡（EVs），尤其是外泌体，已成为细胞间通讯的关键介质，在增强和缓解衰老方面均具有潜在作用。本综述旨在综合现有关于EVs在衰老和年龄相关疾病中的机制与治疗作用的文献。
方法：利用Web of Science、Scopus和PubMed数据库进行了一项综合性叙述性综述。纳入了评估EVs在衰老、细胞衰老、再生生物学和年龄相关疾病中作用的研究。对临床前和临床研究均进行了定性分析，重点关注EV来源、分子通路和治疗结果。
结果：来源于年轻细胞或干细胞的EVs在多个系统中展现出强大的抗衰老特性，如免疫、肌肉骨骼、心血管和神经系统等。这些影响通过减轻细胞衰老、重建线粒体活性、恢复线粒体自噬和自噬信号、调节炎症信号以及改善组织再生来介导。相反，来源于疾病或衰老细胞的EVs则会促进促衰老表型，如炎症、纤维化和代谢失调，强调了其背景依赖的双重性。临床前证据一致支持EV介导的疗法；然而，由于EV亚群异质性、缺乏标准化分离方案以及生物活性载荷的变异性，临床转化仍受到限制。
结论：EVs代表了衰老生物学中具有前景的治疗剂和生物标志物，具有同时调节多个衰老标志的潜力。未来研究应优先关注标准化、靶向生物工程和严格的临床验证，以实现成功的抗衰老干预。
1 引言
全球人口老龄化带来的社会和经济影响日益增加，已将衰老相关研究推至聚光灯下。近几十年来，医学进步显著延长了全球预期寿命。预计到2050年，超过20亿人将超过60岁。这一人口基准将伴随着年龄相关疾病的大幅增加，包括糖尿病、癌症、心血管疾病（CVDs）和阿尔茨海默病（AD），这些疾病在60岁以后每5年发病率有效翻倍。衰老与这些疾病之间的关联激发了关于衰老机制及减轻其影响策略的基础研究。
衰老是一个复杂的多因素现象，涉及多种细胞和分子过程，其中细胞衰老起关键作用。传统上，细胞衰老被定义为由多种应激源（如DNA损伤、端粒磨损、氧化应激、致癌信号和线粒体失调）诱导的细胞周期停滞的稳定状态。然而，证据表明衰老并非仅是与年龄相关的病理机制，而是一种基于背景的生物过程，在生命过程中服务于重要的生理活动。瞬时衰老有助于正常胚胎发育，帮助组织重塑和伤口修复，并通过阻止受损或潜在恶性细胞的增殖发挥强大的肿瘤抑制途径。在生理状态下，衰老细胞在完成有益功能后通常被免疫系统有效清除。相反，在慢性疾病和衰老过程中，清除功能受损导致衰老细胞沉积，持续释放统称为衰老相关分泌表型（SASP）的促炎和组织重塑因子。这些细胞的逐渐沉积被认为是组织失调、慢性炎症和年龄相关障碍的主要决定因素。越来越多的证据表明，衰老细胞分泌细胞外囊泡（EVs），如外泌体。
根据国际细胞外囊泡学会（ISEV），EVs是一个通用术语，指缺乏细胞核且无法复制的膜包裹颗粒。几乎所有细胞都释放EVs，作为细胞间通讯的调节因子。根据其生物发生机制，EVs被分类为凋亡小体、微囊泡和外泌体。外泌体（直径30–150 nm）在多泡体（MVBs）与细胞膜融合后释放；微囊泡（直径100–1000 nm）直接从细胞膜出芽；凋亡小体（直径50–5000 nm）在凋亡过程中产生。外泌体携带多种生物分子，如代谢物、核酸（DNA、miRNA、mRNA和非编码RNA）、脂质、蛋白质、糖缀合物和其他化学实体。四旋蛋白（即CD9、CD63和CD81）是外泌体的经典表面生物标志物。TSG101、Alix和syntenin-1因其一致的蛋白质丰度而被日益认为是外泌体的新型生物标志物。外泌体货物通过多种机制影响受体细胞，包括表面配体直接刺激、活化受体转移以及通过递送蛋白质、RNA和脂质进行表观遗传重编程。
2 衰老的历史方面
有趣的是，1925年的研究发现光照强度差异可影响果蝇的生长速率和寿命。这一发现激发了衰老学科的显著研究兴趣。此外，热量限制已被发现可影响小鼠模型的衰老、年龄相关状况和长寿。这些发现强调了衰老过程固有的可塑性对长寿的重要意义。近30年前，在秀丽隐杆线虫中鉴定了第一个长寿品系，标志着衰老研究新时代的开始。数十年来，生物学家推测衰老与人类多种慢性疾病之间存在潜在重要但未充分认识的关联，衰老增加了对众多常见疾病的易感性，如骨关节炎（OA）、骨质疏松症、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、CVDs、帕金森病（PD）、AD和糖尿病（DM）。
细胞衰老在维持正常组织稳态和病理状态中发挥重要作用，作为生物体衰老过程的主要致病因素，促进衰老和衰老相关疾病。细胞衰老是细胞增殖和分化能力以及生理功能随时间的进行性衰退。1956年，Denham Harman提出了衰老的自由基理论，认为衰老过程中的退行性变化由正常细胞代谢过程中产生的自由基的有害效应所调控。1961年，成纤维细胞的寿命首次被确定为有限的。此后，已鉴定出众多介导衰老的分子机制，包括表观遗传修饰、干细胞耗竭、线粒体失调、蛋白质稳态丧失和端粒功能障碍。衰老过程受众多重要而复杂的通路调控；其中许多调控因子与活性氧（ROS）水平升高诱导的慢性氧化应激相关。
3 衰老的机制和标志
多项研究分析了衰老如何发生以及如何在生命不同阶段受复杂分子和细胞通路调控。多种导致衰老过程和长寿的因素已被阐明。衰老速度至少部分受遗传通路和进化保守的生化机制控制的发现，推动了衰老研究的重大进展。衰老从根本上代表损伤随时间的积累，以特定的生理形式表现，称为衰老标志。
“标志”之间的区别本质上是模糊的，因为它们相互作用且并非相互独立。因此，其分类不可避免地具有主观性；然而，López-Otín等人提出了必须适用于个体衰老标志的三个基本标准：（i）伴随衰老过程的改变的时序表现；（ii）通过实验性增强该标志加速衰老的潜力；以及最关键的是（iii）通过靶向该标志的治疗干预减缓和停止或逆转衰老的能力。
2013年，López-Otín等人提出衰老的九个系统性、细胞和分子标志：（i）DNA不稳定性，（ii）端粒磨损，（iii）表观遗传改变，（iv）蛋白质稳态丧失，（v）营养感应失调，（vi）线粒体失调，（vii）细胞衰老，（viii）干细胞耗竭，以及（ix）细胞间通讯改变。近期研究已验证并扩展了这些标志的重要性。例如，2013年，关于抗衰老疗法的大部分证据仅限于非哺乳动物模型系统，如果蝇、线虫和酵母。幸运的是，涉及小鼠的研究现已证实了这些标志在哺乳动物中的大多数相关性。重要的是，当人类年龄相关疾病与同一标志而非不同标志存在因果关联时，它们在统计学上更可能共现并共享基因组特征。
结合对先前标志的必要更新，López-Otín等人进行了重组并纳入衰老的三个新标志：（x）巨自噬功能失活，（xi）慢性炎症，以及（xii）菌群失调。巨自噬功能失活最初被归类为蛋白质稳态丧失的特例。然而，巨自噬不仅影响蛋白质，还可靶向整个细胞器和非蛋白质大分子，证明其作为独立类别的合理性。此外，他们确定2013年鉴定的最终标志，即细胞间通讯改变，过于宽泛，需要单独讨论年龄相关菌群失调和慢性炎症。衰老标志的相互关联性意味着对一个特定标志的实验性抑制或刺激通常同时影响其他标志。这强调衰老是一个必须整体考虑的复杂过程。因此，个体标志应被视为未来衰老研究以及新抗衰老疗法制定的切入点。
3.1 基因组不稳定性
基因组稳定性受到外部和内部挑战的影响，这些应激产生转座子或病毒插入、端粒缩短、染色体重排、缺失和基因突变，形成基因组嵌合现象，导致衰老和疾病。尽管细胞拥有广泛的DNA修复系统，但其效率随年龄下降，导致线粒体DNA（mtDNA）和核损伤积累。在核DNA中，拷贝数变异、非整倍体和体细胞突变随时间增加，损害关键基因、破坏干细胞活性并加剧组织失调。体细胞突变率较低的物种寿命更长，DNA修复缺陷加速衰老。相反，改善的修复能力，包括Sirtuin-6（SIRT6）上调，可延长动物寿命。mtDNA由于修复受限和高复制率而特别脆弱。年龄相关的mtDNA缺失和突变通常来自复制缺陷，通过克隆扩增积累并可调控衰老表型。最终，核结构错误，尤其是核纤层中的错误，使基因组失调并导致早衰障碍。
3.2 端粒磨损
端粒是染色体末端的特化DNA-蛋白质结构，由于标准DNA聚合酶无法完全复制它们，端粒随每轮细胞分裂逐渐缩短。随着端粒侵蚀，染色体变得不稳定，刺激DNA损伤反应，调节细胞进入凋亡或衰老。端粒酶是一种逆转录酶，通过延伸端粒来抵消这种缩短，但大多数哺乳动物体细胞缺乏端粒酶活性，导致衰老过程中端粒累积丢失。虽然端粒磨损可通过限制恶性细胞增殖来限制癌症，但也削弱组织再生，使其成为独特的衰老标志。在小鼠中的研究表明端粒长度因果性地影响衰老：端粒酶刺激或端粒较长的小鼠更健康且寿命更长，而端粒酶缺失加速衰老。
3.3 表观遗传改变
表观遗传改变，包括逆转录转座子功能改变、非编码RNA（ncRNAs）、染色质重塑、组蛋白修饰和DNA甲基化，随年龄积累并改变基因表达，导致代谢疾病、神经退行性变、癌症和其他年龄相关疾病。衰老DNA甲基化组表现出整体低甲基化以及多梳介导基因和肿瘤抑制基因的位点特异性高甲基化。这些甲基化修饰部分由早衰综合征再现。以DNA甲基化为中心的表观遗传时钟可预测疾病风险和生物学年龄，并可通过包括α-酮戊二酸补充或胸腺再生的疗法逆转，尽管在衰老中的因果性尚未得到证实。衰老还与组蛋白标记和组蛋白丢失的改变相关，如H3K27me3和H3K9me3减少以及H3K4me3和H4K16ac增加。长寿介导的组蛋白酶，如去乙酰化酶：SIRT-1、SIRT-3、SIRT-6和SIRT-7，增强干细胞活性、代谢和基因组稳定性，SIRT-6上调延长寿命。相反，抑制组蛋白乙酰转移酶（包括KAT7）可延长寿命并减少衰老。此外，ncRNAs尤其是miRNAs介导衰老：miR-188-3p增强血管衰老，而miR-455-3p促进线粒体活性和长寿。最终，逆转录转座子（包括LINE-1）的表观遗传去抑制刺激基因组不稳定性和炎症。通过反义寡核苷酸或逆转录酶抑制剂抑制逆转录转座子可延长小鼠寿命，提示其在衰老中的因果作用。
3.4 蛋白质稳态丧失
衰老和多种年龄相关疾病与蛋白质稳态受损相关，导致泛素化、糖化、氧化和错误折叠蛋白质积累，聚集成细胞外淀粉样斑块或细胞内包涵体。当蛋白质折叠减慢、易出错且受损蛋白质积累时，蛋白质稳态下降。通过改变核糖体蛋白提高翻译保真度可延长果蝇、蠕虫和酵母的寿命，而易出错的翻译加速小鼠衰老。此外，氧化应激压倒伴侣蛋白，而易于聚集的蛋白质调控神经退行性疾病。此外，蛋白质质量控制随年龄失效，原因是泛素化蛋白积累、蛋白酶体功能下降和未折叠蛋白反应信号下降。通过伴侣调控自噬（CMA）的溶酶体分解依赖于HSC70和LAMP2A；LAMP2A水平随年龄下降，其恢复可改善肝脏衰老。通过改善蛋白质稳态延缓衰老；减少内质网（ER）应激、刺激CMA或增强蛋白酶体活性可促进模式生物的认知并延长寿命。
3.5 巨自噬功能失活
巨自噬是一种溶酶体回收机制，受损细胞器和细胞质物质被自噬体吞噬并在与溶酶体结合后分解。除清除蛋白质外，自噬还消除入侵病原体、多余脂质和有缺陷的线粒体，从而维持细胞稳态。自噬随年龄减弱，日益被认为是衰老的标志。在人类中，关键自噬基因（Beclin 1 [BECN1]、自噬相关基因5 [ATG5]和ATG7）的表达随年龄下降，而长寿个体的免疫细胞表现出改善的自噬。自噬减弱增强受损细胞器和蛋白质的积累并加剧炎症。自噬的遗传抑制加速小鼠衰老：诱导性ATG5抑制导致过早器官退化和死亡，恢复自噬后可部分逆转。此外，自噬抑制癌症形成，自噬相关基因突变导致类似早衰的人类疾病。相反，自噬激活延长寿命。ATG5上调或BECN1刺激可延长小鼠寿命并减少年龄相关疾病。亚精胺补充可诱导自噬并以ATG7依赖性方式延长寿命。相反，尿石素A和NAD+前体改善线粒体自噬，从而增强人类和小鼠的健康寿命。
近期研究表明，来源于间充质干细胞（MSCs）和年轻细胞的EVs尤其是外泌体，可能通过重建线粒体自噬和自噬信号传导赋予其部分抗衰老效应。鉴于自噬对清除受损蛋白质、失调细胞器和衰老细胞成分至关重要，EV依赖性改善自噬流代表连接多个衰老标志的合理通路。外泌体货物（如蛋白质和调控RNA）已被证明可调控中枢自噬相关信号，包括Beclin-1、SIRT1、mTOR和AMPK，从而增强应激抵抗和细胞稳态。此外，基于EV的线粒体自噬激活可支持清除受损线粒体、减少ROS生成并减轻线粒体失调。
3.6 营养感应失调
营养感应网络包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）、叉头框O（FOXO）转录因子、大鼠肉瘤-细胞外信号调节激酶通路（Ras–ERK）、磷酸肌醇3-激酶-蛋白激酶B（AKT）（PI3K-AKT）、胰岛素样生长因子（IGF）信号和胰岛素，以介导应激反应、自噬、蛋白质合成和代谢。该网络的遗传减少延长了众多物种的寿命，人类寿命与FOXO3及该通路其他成分的变体相关。此外，表观遗传年龄与营养感应活性相关。尽管该系统在青年期促进生长，但在生命后期转变为促衰老作用。生长激素/胰岛素样生长因子-1（GH-IGF-1）内分泌轴通过PI3K-AKT-mTORC1通路促进生长。抑制或突变该信号可延长小鼠的寿命和健康寿命。ALK通路受摄食刺激，也调控胰岛素样肽和脂质代谢；其抑制增强瘦弱表型并延长人类、小鼠和果蝇的寿命。通过雷帕霉素药理学抑制mTORC1即使在晚期启动治疗也可延长动物寿命并增强健康，并改善老年人的病毒抵抗力和免疫反应。抑制IGF1R通路可增强小鼠的寿命、抗癌免疫和心脏衰老，而人类IGF-1浓度降低与痴呆和死亡减少相关。生酮饮食、禁食和热量限制抑制E1A结合蛋白P300（EP300）和mTORC1，刺激去乙酰化酶和单磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK），激活自噬，并延长多个物种的寿命。酮体（包括3-羟基丁酸）通过增强代谢健康和减轻炎症来调控部分这些益处。
3.7 线粒体功能障碍
线粒体产生细胞能量，但当mtDNA或ROS易位至胞质或线粒体膜完整性受损时，也会诱导炎症和凋亡。随衰老，线粒体活性因动力学改变、周转减少、蛋白质稳态丧失和mtDNA突变而下降，导致生物能量受损、ROS过剩、炎症和凋亡。延长健康寿命的疗法可促进线粒体活性：左旋肉碱补充可改善老年人的衰弱，而轻度线粒体应激刺激线粒体激素效应，从而通过刺激线粒体未折叠蛋白反应延长果蝇和蠕虫的寿命。在灵长类和小鼠中，质子载体或部分线粒体解偶联通过刺激自噬和线粒体自噬增强代谢健康。心磷脂特异性药物（即elamipretide）稳定线粒体膜并改善人类和小鼠的衰老表型。线粒体编码的微蛋白，包括12S rRNA型-c线粒体开放阅读框（MOTS-c）和人in，随年龄下降，但恢复后改善胰岛素敏感性、自噬和长寿，将线粒体完整性与生理衰老联系起来。
3.8 细胞衰老
细胞衰老代表由代谢或致癌应激、感染、线粒体失调、DNA损伤和端粒侵蚀引发的应激反应。衰老细胞在多种组织中随年龄增加，从年轻到年老群体升高2–20倍，其局部积累与多种疾病相关。衰老细胞的药理学或遗传消除可延长啮齿动物模型的健康寿命和寿命，并改善众多年龄相关疾病，促进正在进行的临床研究。
衰老由p16-RB和TP53-p21信号调控，形成稳定的细胞周期停滞和染色质重塑，其特征是lamin B1耗竭和异染色质灶生成。衰老细胞释放由溶酶体扩张、线粒体ROS和LINE-1去抑制介导的复杂SASP。SASP增强旁分泌衰老、干细胞失调、免疫调节、纤维化和炎症。
生理上，衰老通过吸引免疫细胞清除受损细胞促进组织愈合；然而，衰老削弱这种清除，导致病理积累。特异性根除衰老细胞的衰老清除药物，包括强心苷、非瑟酮、达沙替尼+槲皮素和navitoclax，可延长小鼠寿命并减轻疾病。此外，针对衰老细胞表面蛋白的免疫疗法展现了前景，使衰老清除成为对抗衰老的潜在治疗策略。
3.9 干细胞耗竭
衰老削弱组织修复和再生，器官特异性方法调控这些过程。骨骼肌依赖于卫星细胞的单能层级，而表皮由多样化的干细胞群体组成，能够进行损伤引发的可塑性。在低周转率器官中，分化细胞可通过去分化和胚胎转录通路重新激活获得干细胞样特征。这种损伤引发的可塑性随年龄逐渐减弱，可能比稳定状态下的干细胞对组织维持更为重要。
细胞重编程提供了对抗这种衰退的有前景方法。MYC原癌基因、bHLH转录因子（MYC）、Krüppel样因子4（KLF4）、SRY-box转录因子2（SOX2）和Octamer结合转录因子4（OCT4）的强制表达将体细胞转化为诱导多能干细胞（iPSCs），重置衰老标志，如转录组特征、表观遗传状态和端粒长度。值得注意的是，瞬时或部分重编程可通过消除年龄相关分子特性来恢复细胞活力而不损害其身份。在体内，瞬时重编程促进再生潜力并重建多个组织的功能，增强年老生物的更新并抵消年龄相关疾病的某些方面。这些影响模仿涉及瞬时重和去分化的自然愈合机制，反映整合表观遗传复兴与细胞可塑性可能突出恢复衰老期间组织活性的治疗策略。
3.10 细胞间通讯改变
衰老代表细胞间通讯的修改，提高系统性噪声并削弱应激反应和稳态。代谢、激素和神经通路的减弱，如性激素、IGF-1/胰岛素、多巴胺能和肾上腺素能信号，导致生物体失调。这些改变将细胞内在损伤与元细胞影响交织在一起；重要的是，微生物组失调、免疫监视下降和慢性炎症。
衰老血液中的促衰老线索，包括C1q、TGF-β、IL-6、β2-微球蛋白和CCL11，损害组织愈合、造血和神经发生，而中和或稀释这些因素可增强复兴。相反，系统性变量，如VEGF、GDF11、IL-37、TIMP2和CCL3，恢复代谢活性和再生潜力，而背景介导的不利影响可能发生。细胞间通讯包括通过直接细胞接触、EVs和可溶性因子的短程信号和长程神经内分泌介导，所有这些在衰老过程中均受干扰。此外，由蛋白质损伤、纤维化和硬度增加控制的细胞外基质（ECM）重塑，通过包括WNT、YAP/TAZ和TGF-β的信号损害细胞活性并增强促纤维化和促炎通路。
3.11 慢性炎症
被称为“炎症衰老”的慢性低度炎症是衰老的定义性标志，具有组织特异性和系统性影响，如椎间盘退变、骨关节炎、神经炎症和动脉粥样硬化。炎症调节因子，包括C反应蛋白（CRP）和IL-6，随年龄升高，IL-6作为全因死亡率的预测因子。同时，免疫活性减弱，表现为自身免疫增强、免疫监视受损和促炎性T细胞积累，总体促进系统性炎症。
炎症衰老源于与其他衰老标志的关联。克隆性造血、基因组不稳定性和胞质DNA积累介导促炎级联反应，主要通过IL-6和IL-1β。其他因素包括过度活跃的营养感应信号、缺陷自噬、受损蛋白质稳态和表观遗传功能障碍。衰老细胞通过SASP增加炎症，而免疫耗竭和胸腺退化进一步损害适应性免疫。
衰老可通过靶向炎症进行调控。药理学和遗传学疗法，包括抑制NLRP3炎症小体功能、IFN信号、IL-1β和TNF-α，可增强组织功能、延长健康寿命，在某些情况下延长动物模型的寿命。临床研究，如IL-1β抑制，强化了抗炎方法减少年龄相关疾病的转化潜力。
3.12 菌群失调
肠道微生物群是宿主生理的关键介质，通过生物活性代谢物（包括胆汁酸和短链脂肪酸）在系统信号、免疫活性和营养代谢中发挥重要作用。宿主-微生物群轴的失调导致菌群失调，促进肿瘤、神经、心血管（CVS）、炎症和代谢疾病。
随衰老，肠道微生物组经历以多样性减少和组成改变为特征的逐渐重塑，而趋势因个体生活方式、环境和遗传决定因素而异。衰老与核心类群（拟杆菌属）减少和个体间异质性升高相关，独特的微生物谱与生存和健康状态相关联。此外，微生物来源的代谢物随年龄改变，即促炎化合物与衰弱相关，而吲哚代谢物通过抗炎通路增强健康寿命。在衰老中，功能研究支持菌群失调的因果贡献。从年轻到年老啮齿动物的粪便微生物移植增强了认知、免疫活性、寿命和健康寿命，而年老微生物群的转移则诱发代谢失调和炎症。
