迷迭香酸通过靶向FYN调控铁死亡减轻顺铂诱导的急性肾损伤

《Food Science & Nutrition》：Rosmarinic Acid Alleviates Cisplatin-Induced Acute Kidney Injury by Targeting FYN to Regulate Ferroptosis

　　

顺铂(CDDP)是一种广泛使用的化疗药物，但其肾毒性副作用限制了其临床应用，可导致严重的急性肾损伤(AKI)。越来越多的证据表明，铁死亡在CDDP-AKI中发挥关键作用。迷迭香酸(RA)是一种从多种植物中提取的天然多酚类化合物，已被证明具有显著的抗氧化和抗炎活性。本研究旨在探讨RA是否通过调控铁死亡来保护CDDP-AKI。研究人员证明，RA显著改善了CDDP-AKI小鼠的肾功能障碍、病理损伤和炎症反应。此外，RA通过调控Nrf2/HO-1信号轴有效抑制铁死亡，表现为脂质过氧化水平降低以及关键铁死亡相关蛋白(GPX4和xCT)表达恢复。结合网络药理学预测与分子对接，研究人员将FYN鉴定为RA的潜在直接靶点，并进一步验证RA抑制FYN的表达和激活。此外，在体内使用Saracatinib对FYN进行药理学抑制，或在HK-2细胞中对FYN进行基因敲低，均有效减轻了CDDP诱导的肾小管损伤和脂质代谢失调。总之，研究结果表明，RA通过靶向FYN调控铁死亡通路来减轻CDDP-AKI，凸显了RA作为预防和治疗CDDP-AKI的有前景的候选药物。

**论文解读：迷迭香酸通过靶向FYN调控铁死亡减轻顺铂诱导的急性肾损伤**

**一、研究背景与目的**

急性肾损伤(AKI)是一种以肾功能迅速下降为特征的危重临床综合征，其病因多样，包括药物毒性、缺血再灌注损伤和感染等。顺铂(CDDP)是广泛应用于肺癌、膀胱癌和卵巢癌等多种实体恶性肿瘤的一线化疗药物，其高效的细胞毒性作用使其成为重要的治疗药物。然而，CDDP的临床应用受到剂量依赖性肾毒性的显著限制。据统计，接受CDDP治疗的患者中AKI发生率高达30%，显著增加死亡率，且由于缺乏有效的AKI治疗策略，常迫使CDDP治疗中断。CDDP-AKI的主要病理特征为肾小管上皮细胞损伤，传统上认为其机制涉及氧化应激、线粒体功能障碍和凋亡通路激活。然而，新近证据强调铁死亡在多种病因所致AKI中发挥关键作用。铁死亡是一种新型的铁依赖性调节性细胞死亡形式，由铁催化的脂质过氧化物积累驱动，破坏膜完整性并最终导致细胞死亡。CDDP通过加重细胞内铁过载、放大脂质过氧化级联反应、导致谷胱甘肽耗竭以及灭活谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)来加剧这一病理过程。核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路对铁死亡过程具有重要的调控作用。Nrf2是一种重要的抗氧化转录调控因子，激活后转位至细胞核，与下游基因启动子区的抗氧化反应元件(AREs)结合，上调包括HO-1在内的抗氧化基因转录，促进谷胱甘肽(GSH)的合成和稳态维持，抑制活性氧(ROS)的产生和积累，从而阻断铁死亡特征性的脂质过氧化反应。已有研究报道，水飞蓟宾通过干扰铁蛋白自噬过程抑制铁死亡并改善缺血再灌注诱导的AKI；法尼醇X受体通过调控铁死亡相关基因的转录预防CDDP诱导的AKI。基于上述结果，靶向铁死亡可能成为CDDP-AKI的一种有前景的治疗策略。

迷迭香酸(RA)是一种天然多酚类化合物，广泛分布于唇形科和紫草科药用植物中，因其显著的抗氧化、抗炎和抗微生物特性而备受关注。随着对天然产物研究的深入，RA在慢性炎症性疾病、神经退行性疾病、过敏性哮喘和癌症等领域的潜在治疗作用逐渐被揭示。最新研究报道，RA通过调控铁死亡改善多种疾病状态，如挤压综合征相关AKI、缺血性脑卒中和脓毒症相关急性呼吸窘迫综合征。然而，RA对CDDP-AKI中铁死亡的影响尚不清楚。本研究旨在探究RA是否通过调控铁死亡保护CDDP-AKI，并阐明其潜在分子机制。

**二、主要技术方法**

本研究采用多种实验技术手段。在动物水平，研究人员以8周龄雄性C57BL/6J小鼠(体重22–24 g，购自苏州大学动物实验中心)为研究对象，通过单次腹腔注射20 mg/kg CDDP建立CDDP-AKI小鼠模型，并给予不同剂量的RA(25、50、100 mg/kg)、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)或FYN抑制剂Saracatinib干预。采用全自动生化分析仪检测血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)评估肾功能；苏木精-伊红(H&E)和过碘酸雪夫(PAS)染色评估肾组织病理学改变；免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)检测蛋白表达定位及水平；透射电子显微镜(TEM)观察线粒体超微结构；TUNEL法检测细胞凋亡。在细胞水平，以人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2细胞(购自武汉普诺赛生命科技有限公司)为模型，采用CCK-8法检测细胞活力，BODIPY 581/591 C11荧光探针检测脂质过氧化水平，并利用短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体敲低FYN基因。分子生物学层面，采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测mRNA和蛋白表达水平；利用网络药理学预测(SwissTargetPrediction数据库)结合分子对接(AutoDock Vina)鉴定RA的直接靶点。此外，使用商业化试剂盒检测GSH、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，以评估抗氧化防御能力和脂质过氧化程度。

**三、研究结果**

**3.1 RA改善CDDP-AKI小鼠的肾功能障碍和病理损伤**

通过建立CDDP-AKI小鼠模型，研究人员评估了RA的肾脏保护作用。结果显示，CDDP-AKI小鼠血清Scr和BUN水平显著升高，H&E和PAS染色显示明显的肾小管损伤，表现为肾小管腔扩张、肾小管上皮细胞坏死、蛋白管型形成和刷状缘丢失。Fer-1干预可显著减轻上述肾损伤，证实铁死亡参与CDDP-AKI的病理过程。与Fer-1作用一致，不同剂量的RA治疗均显著改善了CDDP-AKI小鼠的肾功能和肾组织病理状态。此外，CDDP-AKI小鼠肾组织中肾小管损伤标志物Kim-1和NGAL的蛋白和mRNA表达水平显著上调，而RA和Fer-1处理均显著抑制了这一趋势。以上结果表明RA能有效预防CDDP-AKI的肾功能障碍和病理损伤。

**3.2 RA减轻CDDP-AKI小鼠的炎症反应**

免疫效应细胞浸润和细胞因子风暴是CDDP-AKI过程中的重要特征。IHC染色显示，CDDP-AKI小鼠肾组织中F4/80阳性面积比显著大于对照组，表明巨噬细胞浸润增加，而Fer-1或RA治疗后这一增加显著减少。ELISA结果显示，与对照组相比，CDDP-AKI小鼠血清和肾组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平显著升高，Fer-1和RA处理均能逆转这一趋势。qPCR进一步证实，Fer-1和RA显著抑制了CDDP-AKI小鼠肾组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达水平。这些结果表明RA能有效抑制CDDP-AKI相关的炎症反应。

**3.3 RA抑制CDDP-AKI小鼠的铁死亡**

研究人员进一步探讨了RA是否调控铁死亡。与对照组相比，CDDP-AKI模型组GSH和SOD水平降低，MDA水平升高，而Fer-1或RA处理显著逆转了这些变化。GPX4和xCT是关键的铁死亡标志物。IHC结果显示，CDDP-AKI小鼠肾组织中GPX4蛋白表达显著降低，Fer-1或RA处理后显著恢复。此外，CDDP-AKI组Nrf2的核表达显著减少，而Fer-1和RA补充增强了其核转位。TEM观察显示，CDDP组出现严重的线粒体损伤，表现为线粒体皱缩、嵴破坏和膜破裂，Fer-1和RA处理显著减轻了这些损伤。qPCR和WB结果一致证实，Fer-1和RA逆转了CDDP诱导的GPX4、xCT、Nrf2和HO-1在mRNA和蛋白水平的表达下调。综上表明，RA可能通过Nrf2/HO-1信号通路调控铁死亡来保护CDDP-AKI。

**3.4 RA减轻CDDP-AKI中HK-2细胞损伤和铁死亡**

体外实验中，CCK-8检测显示CDDP显著抑制HK-2细胞活力，而RA逆转了这一抑制作用。qPCR和WB分析显示，RA降低了NGAL和Kim-1的mRNA和蛋白表达水平。利用铁死亡诱导剂erastin在HK-2细胞中建立铁死亡模型，RA恢复了erastin诱导的细胞内GSH和SOD水平下降，同时降低了MDA含量。BODIPY-C11荧光探针检测显示，RA抑制了erastin诱导的脂质过氧化。此外，RA恢复了GPX4和xCT的mRNA表达水平，并消除了erastin诱导的GPX4、xCT、Nrf2和HO-1蛋白水平下降。研究人员还观察到RA促进了Nrf2的核蛋白表达，表明其增强了Nrf2的核转位。这些结果证实RA通过Nrf2/HO-1信号通路减轻CDDP诱导的HK-2细胞损伤并抑制erastin诱导的铁死亡。

**3.5 FYN被鉴定为RA的直接靶点**

为探究RA调控铁死亡的分子机制，研究人员利用SwissTargetPrediction数据库预测RA的潜在治疗靶点。在Mus musculus和Homo sapiens中，酪氨酸蛋白激酶FYN均被鉴定为RA最主要的候选靶点。分子对接进一步揭示了RA与FYN之间的直接结合作用。研究人员随后检测了RA对FYN表达及其磷酸化水平的影响。RA显著降低了FYN的mRNA表达水平。IF显示FYN主要定位于细胞质，RA显著降低了其荧光强度。WB进一步证实RA下调FYN蛋白表达并抑制其活性。这些结果表明FYN是RA的直接靶点。

**3.6 FYN的药理学抑制改善CDDP-AKI小鼠的肾损伤和脂质代谢紊乱**

为探究FYN在CDDP-AKI中的作用，研究人员通过腹腔注射Saracatinib对FYN进行药理学抑制。结果显示，FYN的药理学抑制显著改善了CDDP-AKI小鼠的肾功能，并减轻了肾小管组织病理学损伤。IHC显示，CDDP-AKI小鼠中Kim-1、NGAL和ACSL4的表达显著增加，而GPX4表达降低，Saracatinib处理显著逆转了这些变化。Saracatinib恢复了GSH和SOD水平并降低了MDA水平，表明抑制了脂质过氧化。此外，CDDP处理显著增加了Kim-1、NGAL、ACSL4和LPCAT3的mRNA水平，同时降低了GPX4和xCT的mRNA水平，Saracatinib显著逆转了这些改变。WB分析表明，Saracatinib显著降低了NGAL、Kim-1、ACSL4、LPCAT3、总FYN和磷酸化FYN的蛋白表达，并上调了GPX4、xCT、Nrf2和HO-1的蛋白水平。这些结果表明FYN的药理学抑制可有效缓解CDDP-AKI的肾损伤和脂质代谢紊乱。

**3.7 FYN敲低抑制CDDP诱导的HK-2细胞损伤和脂质代谢紊乱**

为进一步在体外验证FYN的作用，研究人员利用shRNA在HK-2细胞中敲低FYN。CCK-8检测表明FYN敲低显著增强了HK-2细胞的活力。qPCR分析显示，FYN沉默下调了NGAL、Kim-1、ACSL4和LPCAT3的mRNA水平，同时增加了GPX4和xCT的mRNA表达。此外，FYN敲低显著增加了细胞内GSH和SOD水平，降低了MDA含量，并显著抑制了HK-2细胞中BODIPY-C11荧光从红到绿的转变，表明脂质过氧化受到抑制。WB分析显示，FYN敲低降低了NGAL、Kim-1、ACSL4、LPCAT3、总FYN和磷酸化FYN的蛋白表达，同时增加了GPX4、xCT、Nrf2和HO-1的表达。总之，这些结果表明FYN敲低有效减轻了CDDP诱导的肾小管上皮细胞损伤和脂质代谢失调。

**四、讨论与结论**

CDDP是多种癌症的一线化疗药物，但其临床应用受到严重副作用特别是肾毒性和耳毒性的限制。本研究探讨了天然产物RA对CDDP-AKI的保护作用。机制上，RA通过靶向FYN调控铁死亡来减轻CDDP-AKI，为CDDP相关肾损伤的靶向防治提供了新的实验依据。

RA是一种富含于唇形科和紫草科植物中的天然多酚，具有强效的抗氧化、抗炎和抗菌活性，已被广泛报道用于治疗多种疾病。既往研究表明，RA通过Nrf2/Keap1轴阻断铁死亡以缓解挤压综合征相关AKI。与先前证据一致，本研究结果证明RA显著减轻了CDDP-AKI中的肾小管损伤、炎症浸润和线粒体功能障碍，凸显了其在顺铂诱导肾毒性中的治疗价值。

越来越多的证据将铁死亡与各种肾脏疾病的组织和细胞损伤联系起来。本研究中，RA恢复了GSH和SOD水平，上调了GPX4和xCT表达，降低了MDA水平，并有效抑制了脂质ROS积累。铁死亡与线粒体形态改变相关，如膜密度增加、皱缩和嵴减少/消失，TEM显示RA改善了CDDP-AKI中的此类损伤。在氧化应激条件下，Nrf2转位至细胞核，启动保护性基因转录并促进GSH合成以增强抗氧化能力并消除脂质过氧化物。研究结果表明RA激活Nrf2/HO-1通路以抑制CDDP-AKI中的铁死亡。

FYN是Src家族激酶中的关键成员，在癌症中过度活化，靶向抑制其表达可对抗疾病进展。此外，FYN是Nrf2/HO-1轴的关键负调控因子。FYN经磷酸化激活后可诱导Nrf2在Tyr568位点磷酸化，促进Nrf2核输出和降解，并抑制HO-1转录。本研究发现RA直接结合FYN并降低其活性。Saracatinib作为Src家族抑制剂，可同时抑制FYN的表达和活性。FYN的药理学抑制减轻了CDDP-AKI的肾小管损伤和铁死亡，并抑制Nrf2/HO-1信号。这些发现表明RA可能通过降低FYN活性在CDDP-AKI中发挥保护作用。然而，本研究的局限性在于，由于Src家族激酶之间高度结构同源性，目前尚缺乏特异性的FYN抑制剂，未来需要更进一步的体内特异性FYN敲除实验来加强FYN在CDDP-AKI中作用的证据。

综上所述，本研究数据表明RA通过抑制铁死亡减轻CDDP-AKI，这一作用与靶向抑制FYN活性及随后激活Nrf2/HO-1信号通路相关。本研究凸显了RA在CDDP-AKI中的保护作用，并提示其作为肾保护治疗的潜在候选药物。论文发表于《Food Science》。