海带多糖的提取及其对酸奶相关乳酸菌和双歧杆菌生长与保藏的影响

《JOURNAL OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION》：Polysaccharides From Laminaria japonica: Extraction and Effects on the Growth and Preservation of Yogurt-Associated Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria

　　

本研究旨在优化海带（Laminaria japonica）多糖（LJPs）的提取工艺，并评估LJPs对常用于酸奶发酵的乳酸菌（LAB）和双歧杆菌菌株（包括保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis））体外生长与保藏效果的影响。研究人员采用热水提取、微波提取、超声辅助提取及酶辅助提取等多种提取方法，并应用响应面法（RSM）优化提取工艺。将LAB和双歧杆菌菌株接种至含不同浓度LJPs的培养基中，测定微生物活菌数。结果表明，在优化条件（微波时间6.69 min，酶添加量2.77%，纤维素酶与果胶酶比例4:1）下，LJP得率最高。在一定浓度范围内，LJPs通过提高最大生物量并延长贮藏存活期，显著促进了保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和乳双歧杆菌的生长。因此，RSM成功应用于LJPs提取工艺的优化并提高了提取率。此外，LJPs的添加在体外条件下增强了LAB和双歧杆菌的生长与保藏效果。值得注意的是，LJPs延长了三种菌株的稳定期并延缓了衰亡期的到来，且在4°C冷藏条件下长达3周内显著提高了其存活率。本研究为将LJPs开发为改善发酵乳制品中益生菌存活率的潜在功能性添加剂提供了新见解和理论基础。

论文解读

一、研究背景与问题提出

海带（Laminaria japonica）隶属褐藻纲、海带目、海带科，富含多糖、氨基酸、活性肽及脂肪酸等多种生物活性物质，不仅具有食用价值，还具有重要的药用价值。海带多糖（LJPs）作为其主要活性成分之一，已被报道具有抗炎、抗氧化、降脂、免疫增强、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤及益生元等多种生物活性。化学组成上，LJPs是由海带淀粉（laminarin）、岩藻多糖（fucoidan）和褐藻酸盐（alginate）三种多糖构成的异质混合物，其总含量接近海带干重的30%。

乳酸菌（LAB）和双歧杆菌是国际公认的益生菌，具有缓解便秘、抗肿瘤、抗过敏、缓解炎症性肠病和肠易激综合征、改善胃肠功能及调节免疫反应等多种生物学功能。保加利亚乳杆菌（L. bulgaricus）、嗜热链球菌（S. thermophilus）和乳双歧杆菌（B. lactis）是酸奶生产中三种代表性菌株，它们在氧耐受性、产酸能力和生长动力学方面存在显著差异，共同决定酸奶发酵和发酵后贮藏期间的性能。然而，益生菌在酸奶运输和冷藏过程中常因冷诱导氧化应激和营养耗竭而活力下降，胃肠道中的胃酸和胆汁进一步阻碍其存活和定植。因此，提高这三种菌株在加工、贮藏和胃肠道转运过程中活力的策略具有重要的工业意义。

尽管已有研究表明LJPs具有调节肠道菌群、促进乳杆菌和双歧杆菌等有益菌增殖的益生元特性，但关于LJPs对酸奶发酵典型LAB菌株（包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和乳双歧杆菌）生长动力学的直接剂量依赖性影响缺乏系统研究，LJPs延长这些菌株稳定期或延缓衰亡期的潜力尚未被定量表征，LJPs在冷藏条件下对LAB活力的保藏效果也仍未得到探索。此外，传统多糖提取方法如热水提取存在得率低、耗时长的问题，而酸法和碱法提取成本高、污染环境且不可逆地破坏多糖分子结构和生物活性。因此，亟需建立一种既能获得高得率又能保留LJPs生物活性的提取工艺，并系统评估其对酸奶益生菌生长和保藏的影响。

二、研究内容

研究人员系统比较了六种主流提取方法（热水提取、微波提取、超声提取、酶提取、超声辅助酶提取和微波辅助酶提取）的效率，并采用响应面法（RSM）对微波辅助酶提取工艺进行优化。随后，将从市售酸奶产品（伊利品牌，内蒙古伊利实业集团股份有限公司，中国）中分离鉴定的三种菌株（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和乳双歧杆菌）接种至含不同浓度LJPs的培养基中，测定其生长曲线和OD₆₀₀值，评估LJPs对菌株生长动力学的影响。最后，将添加最适浓度LJPs的实验组（PMG）和不含LJPs的对照组（CMG）在4°C下贮藏3周，定期测定活菌数，评估LJPs的冷藏保藏效果。海带样品采集自中国烟台长岛。

三、主要研究结果

（一）不同提取方法的比较

热水提取得率最低，仅为4.91%；超声提取得率为5.81%；微波提取5 min得率为5.47%；酶提取得率达6.42%，显著高于其他单一提取方法。超声辅助酶提取和微波辅助酶提取两种联合方法的提取效率最高且两者无显著差异。鉴于微波辅助酶提取所需时间更短、操作更简便且能更好地保持多糖分子结构，研究人员选择该方法进行后续优化。

（二）单因素实验

在500 W微波功率下提取7 min可获得最高得率；酶添加量为2%时得率达8.02%，此后趋于平稳；纤维素酶与果胶酶比例为4:1时得率最高。

（三）响应面优化

基于单因素实验结果，以微波时间、酶添加量和复合酶比例为自变量，以LJP得率为响应值建立Box-Behnken设计（BBD）。回归方程为：Y = 10.87 ? 0.085A + 0.905B + 0.66C ? 0.14AB ? 0.16AC + 0.57BC ? 1.16A² ? 0.91B² ? 0.20C²。模型F值为35.88，p < 0.01，失拟项p = 0.4241 > 0.05，决定系数R² = 0.97，校正R² = 0.95，表明模型精度高、可靠。三个因素对得率的影响顺序为：酶添加量 > 酶比例 > 微波时间。优化条件为：微波时间6.69 min，酶添加量2.77%，纤维素酶与果胶酶比例4:1，预测得率11.88%。验证实验（微波6 min 40 s，酶添加量2.75%，酶比例4:1）获得平均得率11.82%，与预测值无显著差异。

（四）LJPs对益生菌生长的影响

对保加利亚乳杆菌，0.4% LJPs浓度下OD₆₀₀值最大（6.32），高于对照组（5.77）；添加0.4% LJPs使最大生物量提高至6.59（对照组6.03），稳定期延长至16-36 h（对照组20-28 h），36 h后进入衰亡期（对照组28 h后即进入衰亡期）。对嗜热链球菌，0.8%为最适浓度；实验组对数生长期为4-16 h，稳定期16-24 h，最大生物量OD值为1.65（对照组1.39），36 h时OD值降至1.14，而对照组降至0.65。对乳双歧杆菌，0.6%浓度下OD₆₀₀值最大（5.02，对照组4.75）；实验组稳定期为20-40 h，40 h后进入衰亡期，而对照组稳定期仅为20-36 h。

（五）LJPs对冷藏保藏活力的影响

三种菌株在4°C贮藏3周期间，PMG组活菌数始终高于CMG组。21天后，PMG组保加利亚乳杆菌活菌数为7.81 ± 0.04 lg CFU/mL，嗜热链球菌为6.83 ± 0.02 lg CFU/mL，乳双歧杆菌为8.17 ± 0.04 lg CFU/mL，均高于推荐的最低阈值（6-7 lg CFU/mL）；而CMG组保加利亚乳杆菌和乳双歧杆菌降至约6 lg CFU/mL，嗜热链球菌已低于关键阈值。

（六）粗LJPs组成分析

优化条件下制备的粗LJPs含有85.4% ± 2.3%总碳水化合物、4.1% ± 0.4%蛋白质和5.8% ± 0.7%灰分（干重基）。

四、讨论与结论

讨论部分指出，与既往仅关注得率的提取优化研究不同，本研究将提取工艺优化与益生菌功能验证相衔接，定量证实了优化条件下获得的LJPs对三种酸奶菌株具有明显的促生长和冷保护作用。LJPs的促生长机制可能涉及代谢和营养途径，包括增强丙酮酸代谢、中心碳代谢通路以及磷酸转移酶系统和糖酵解/糖异生相关基因的表达。其冷藏保藏保护机制可能归因于LJPs的抗氧化特性减轻冷贮藏过程中的氧化应激，或通过形成保护性多糖基质包被菌体细胞，维持细胞膜完整性。LJPs作为天然亲水胶体还可能改善酸奶的质构特性和感官品质。

研究结论：本研究首次系统考察了LJPs对酸奶发酵中三种关键益生菌菌株的体外效应，同时优化了得率（11.79%）并保留了生物活性；首次证明LJPs能在4°C条件下维持LAB活力在推荐益生菌阈值（6 lg CFU/mL）以上长达3周。LJPs有潜力作为增强益生菌酸奶发酵性能和货架期稳定性的功能性添加剂，但需进一步体内研究以确认其在肠道环境中的真正益生元功效。该研究为LJPs作为改善保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和乳双歧杆菌在酸奶中生长和活力的潜在功能性添加剂的开发提供了理论依据和技术支持。