《Journal of Extracellular Biology》：Calpeptin Reduces Extracellular Vesicle Secretion and Induces Anti-Inflammatory Effects but Upregulates HO-1 and Alters Adiponectin Levels in Human Adipocytes
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近期研究表明，脂肪组织（AT）在肥胖状态下分泌水平升高的细胞外囊泡（EVs），这些EVs在代谢性疾病中发挥作用。抑制钙蛋白酶（calpains）在体外某些细胞类型中具有抗炎和抗纤维化作用，并可减少EV分泌。然而，其对人类AT及脂肪细胞EV分泌的影响尚未被探索。
近期研究表明，脂肪组织（AT）在肥胖状态下分泌水平升高的细胞外囊泡（EVs），这些EVs在代谢性疾病中发挥作用。抑制钙蛋白酶（calpains）在体外某些细胞类型中具有抗炎和抗纤维化作用，并可减少EV分泌。然而，其对人类AT及脂肪细胞EV分泌的影响尚未被探索。本研究旨在探讨钙蛋白酶抑制剂Calpeptin对EV介导的通讯和脂肪细胞功能的影响，为代谢性疾病的治疗方法提供潜在见解。研究人员将人类Simpson Golabi Behmel综合征（SGBS）前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞，并用Calpeptin处理。通过标准超速离心法分离EVs，并利用纳米颗粒跟踪分析（NTA）、电子显微镜和质谱法进行研究。研究人员采用多种分析手段，包括RNA测序（RNA-seq）、液相色谱-质谱联用（LC–MS）和共聚焦显微镜，研究Calpeptin对SGBS细胞的影响。来自减重手术患者的AT样本在离体（ex vivo）条件下培养，以评估Calpeptin对原代AT的作用。研究人员首次证明，Calpeptin可减少人SGBS脂肪细胞中EV的分泌。蛋白质组学分析显示，Calpeptin改变了与EV分泌途径相关蛋白质的丰度。虽然EV分泌减少伴随抗炎作用，但Calpeptin同时也改变了胰岛素信号通路并降低了脂联素表达，提示其对脂肪细胞代谢存在负面影响。事实上，对细胞和EVs的LC–MS分析显示，Calpeptin改变了细胞和EVs中与应激反应相关的蛋白质。值得注意的是，Calpeptin在体外和离体AT培养中均上调HO-1，表明脂肪细胞和AT中诱导了氧化应激。虽然Calpeptin在人SGBS脂肪细胞中显示出抗炎潜力，但其对胰岛素信号传导、脂联素表达的不良影响以及氧化应激迹象，引发了对其在人类肥胖相关病理学中治疗潜力的担忧。研究结果强调了了解Calpeptin对脂肪细胞代谢更广泛影响的必要性。
**论文解读：钙蛋白酶抑制剂Calpeptin对人脂肪细胞外囊泡分泌、炎症及代谢功能的多重影响**
**研究背景与目的**
肥胖已成为影响全球约13%成年人口的重大公共卫生问题，是心血管疾病、2型糖尿病（T2D）、代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）及某些恶性肿瘤的重要危险因素。在肥胖状态下，脂肪细胞（adipocyte）因营养过剩而体积增大、数量增加，引发应激和炎症反应。脂肪组织（AT）不仅分泌多种激素和脂肪因子，还分泌细胞外囊泡（EVs）——一类纳米至微米级的膜源性颗粒，携带脂质、蛋白质、核酸和糖类，介导细胞间通讯。近年研究表明，肥胖时AT来源的EVs分泌增加，并在代谢性疾病发生发展中发挥作用，因此药理学抑制EV形成与释放被视为潜在治疗策略。钙蛋白酶（calpains）是Ca2?依赖的半胱氨酸蛋白酶，参与细胞骨架重塑、迁移、自噬和凋亡等过程，并调控EV释放。其抑制剂Calpeptin已在多种体外细胞类型中被证实可减少EV分泌，并在肥胖小鼠AT中表现出抗炎和抗纤维化效应。然而，Calpeptin对人类AT及脂肪细胞EV分泌的影响此前未见报道。本研究利用人SGBS脂肪细胞株及肥胖患者AT离体培养模型，系统探究Calpeptin对脂肪细胞代谢和EV介导信号的影响，评估其在肥胖相关病理中的治疗潜力。
**主要技术方法**
研究人员采用人Simpson Golabi Behmel综合征（SGBS）前脂肪细胞株，经标准方案分化为成熟脂肪细胞，以25–300 μM浓度梯度的Calpeptin处理24小时。EVs通过差速超速离心法从条件培养基（CM）中分离，并采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、Western Blotting（WB）和荧光共聚焦显微镜进行表征验证。为全面解析Calpeptin效应，研究人员综合运用了RNA测序（RNA-seq）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学、细胞因子抗体芯片、胰岛素受体磷酸化芯片及免疫荧光染色等技术。此外，研究人员从6名接受Roux-en-Y胃旁路手术的肥胖女性患者（Kuopio OBesity Surgery研究队列）获取内脏脂肪组织（VAT）和皮下脂肪组织（SAT）样本，进行离体培养并给予Calpeptin处理，以验证体外发现的生理相关性。
**研究结果**
**3.1 SGBS EVs的验证研究**：通过荧光标记CD63和CD9四旋蛋白、WB检测EV标志物（CD9、CD63、TSG101、β-actin、Alix及脂肪细胞标志物脂联素）并排除钙联蛋白（calnexin）污染，TEM确认典型杯状形态EVs，NTA与蛋白浓度呈显著正相关（R2=0.9739），证实了EV分离方案的高纯度与可靠性。
**3.2 Calpeptin减少人脂肪细胞EV分泌**：WB显示SGBS细胞中钙蛋白酶-2表达高于钙蛋白酶-1，Calpeptin处理使两者均下调。NTA分析表明，25 μM和50 μM Calpeptin分别使EV分泌减少约30%和26%，而150 μM和300 μM高浓度反而增加EV分泌。低浓度处理未显著改变EV粒径分布，提示不影响EV总体形态。
**3.3 Calpeptin对脂肪细胞诱导抗炎作用**：RT-qPCR证实50 μM Calpeptin抑制CCL2、CXCL8、IL1B、IL6、TNFRSF1A和NFκB1的mRNA表达。细胞因子芯片分析显示CM中MCP-1、IL-8、IL-1β分泌减少，同时多种炎症相关脂肪因子（瘦素、骨桥蛋白、RBP4、抵抗素）及急性期蛋白水平下降，PDGF-A、PDGF-B和cripto-1降低提示潜在抗纤维化效应。RNA-seq共鉴定75个差异表达基因（DEGs），其中59个下调、16个上调，GO富集分析显示下调基因富集于炎症、IL-1和TNF产生、葡萄糖代谢与转运等通路。
**3.4 Calpeptin破坏脂联素信号并上调脂肪细胞中HO-1**：LC-MS蛋白质组学分析鉴定出113个差异表达蛋白，GO分析涉及炎症、外源刺激应答、葡萄糖和过氧化氢相关过程。脂联素蛋白水平显著下调0.53倍，与其mRNA水平下降一致，并经RT-qPCR和WB验证，CM中脂联素也减少。RNA-seq和LC-MS均显示HO-1（由HMOX1编码）表达上调，而触珠蛋白（HP）下调。人AT研究提示HO-1上调与胰岛素抵抗、炎症和氧化应激相关。
**3.5 Calpeptin损害胰岛素信号并改变Glut4定位**：胰岛素受体磷酸化芯片显示Calpeptin降低INSR、IRS1 ser318和IGF1R磷酸化水平。WB进一步验证p-IRS1 ser307呈上升趋势，p-PI3K p55和总Akt水平下降，提示PI3K/Akt通路受抑。共聚焦显微镜观察显示，胰岛素刺激后，对照细胞中Glut4定位于质膜和胞质，而Calpeptin处理细胞中Glut4主要呈胞质聚集，表明其向质膜转位受损。
**3.6 SGBS EVs蛋白质组特征**：首次对SGBS EVs进行全面的LC-MS蛋白质组分析，鉴定出1585种蛋白质，包含常见EV标志物CD63、Alix、β-actin及脂肪细胞特异性标志物脂联素，以及代谢相关蛋白（瘦素、FABP4、FASN、ACACA/ACACB、perilipin-1）和炎症相关蛋白（IL-6、补体C3、HP）。功能富集显示EV蛋白涉及胞外外泌体、胶原细胞外基质、黏着斑等。与Vesiclepedia数据库比较，1057种蛋白匹配，包含100个最常见EV标志物中的75个。SGBS EVs与人类VAT EVs共享243种蛋白，多于SAT EVs（195种），且比小鼠3T3-L1 EVs（126种）更接近人AT EVs。1233种SGBS EV蛋白亦存在于人AT蛋白质组中。
**3.7 Calpeptin降低EV中CD63和环氧化物水解酶1水平**：EV蛋白质组学分析显示，Calpeptin处理后19种EV蛋白丰度发生显著变化，包括CD63、LBP、KRT5、KRT85、1433Z、乳凝集素、IBP3、RTN3等外泌体相关蛋白下调，以及NFIP2、caveolin-1/3、PRAF3、MACF1、OMA1等膜相关蛋白改变。STRING蛋白-蛋白相互作用网络分析揭示了一个以HO-1和脂联素为中心的蛋白簇，两者在RNA-seq和LC-MS数据中一致改变，并与TXN2、IL-1β、HYEP、HP等应激相关蛋白存在相互联系。
**3.8 Calpeptin在患者SAT离体培养中上调HMOX1**：在肥胖患者VAT和SAT离体培养中，50 μM Calpeptin使SAT中HMOX1 mRNA显著上调，VAT和SAT中TXN2和HP呈下降趋势但未达统计学显著。相关性分析显示，25 μM Calpeptin处理的SAT中TXN2表达与患者BMI呈负相关，VAT中HP表达与BMI也呈负相关，提示Calpeptin效应可能受患者肥胖程度影响。
**讨论与结论**
本研究首次证实Calpeptin可减少人SGBS脂肪细胞EV分泌，并发挥抗炎作用，表现为炎症因子表达和分泌下降。然而，Calpeptin同时损害胰岛素信号通路，表现为INSR磷酸化降低、PI3K/Akt通路受抑和Glut4膜转位障碍，并显著下调脂联素的表达和分泌。LC-MS分析揭示Calpeptin诱导细胞和EV中与氧化应激相关蛋白的改变，其中HO-1在体外和患者SAT离体培养中均上调，提示其可能触发氧化应激通路。综合这些发现，虽然Calpeptin在减轻脂肪组织炎症方面展现出潜力，但其对胰岛素信号传导的干扰、脂联素的下调以及氧化应激的诱导等不良效应，提示Calpeptin可能不适合作为对抗人类肥胖相关病理变化的稳健治疗策略。这些结果强调了在评估Calpeptin治疗潜力时，需要全面考虑其对脂肪细胞代谢的更广泛影响。未来研究需采用原代脂肪细胞、扩大样本量并纳入两性，以及开展体内研究以进一步验证。
