《Journal of Extracellular Biology》：Systematic Analysis of Plasma-Derived Extracellular Vesicle-Enriched Samples in Age-Related Macular Degeneration Reveals Oxidative Stress Linked to Altered Lipid and Protein Profiles
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年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）所致的视力损害是一项全球健康优先事项。视网膜病理由衰老驱动，并因遗传和环境风险因素而加剧。外周血液循环日益被认识到是疾病发生和进展的促成因素，也是支持更早诊断和个性化
年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）所致的视力损害是一项全球健康优先事项。视网膜病理由衰老驱动，并因遗传和环境风险因素而加剧。外周血液循环日益被认识到是疾病发生和进展的促成因素，也是支持更早诊断和个性化治疗策略的生物标志物来源。在本研究中，研究人员对来自30例AMD患者和30例对照者的血浆来源细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）富集样本进行了分析。蛋白质组学鉴定出AMD中显著改变的蛋白质，其中大多数为下调，并且涉及补体蛋白和内肽酶抑制剂的强相互作用网络。重要的是，许多改变的蛋白质是已知的AMD生物标志物候选分子，并在影响AMD的通路中发挥作用：氧化应激反应、免疫功能和蛋白水解失调。脂质组学揭示AMD中总鞘磷脂与神经酰胺的比值升高，表明存在脂质代谢缺陷。拉曼光谱通过证明蛋白质和脂质的氧化修饰以及AMD样本中的组成异常，补充了上述发现。因此，AMD血浆EV富集样本携带补体和凝血失调、氧化还原稳态受损以及鞘脂代谢改变的全身性特征，反映了AMD视网膜病理的既定机制。这些与AMD相关的生化谱为开发新的诊断方法和精准医学的机制见解提供了有前景的来源。
**年龄相关性黄斑变性血浆EV富集样本的多组学研究：揭示氧化应激与脂质及蛋白质谱异常的系统性特征**
**1. 研究背景与研究目的**
年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是导致不可逆视力损害的主要全球性公共卫生问题。1990年至2021年间，全球因AMD导致视力损害的人数增长了一倍以上，估计达806万，预计到2050年将增至2134万例。AMD被广泛认为是一种多因素疾病，年龄增长、补体基因及其附近的多态性、MHC II类风险单倍型，以及吸烟和饮食等环境风险因素均与AMD发病风险升高相关。临床上，AMD依据黄斑中心凹两个视盘直径范围内的病灶进行定义，包括中等或大玻璃膜疣、视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）色素异常，以及晚期AMD相关改变（新生血管或地图样萎缩）。玻璃膜疣和网状假性玻璃膜疣的蛋白质及脂质组成差异提示两者具有不同的生物发生途径，并暗示系统性脂质转运可能参与典型玻璃膜疣的形成。
AMD的确切发病机制仍不清楚。目前认为AMD并非单一疾病，而是一组具有不同病理生理学和临床结局的疾病谱。现有研究已表明补体系统失调、炎症因素、自噬缺陷、氧化应激、线粒体代谢缺陷、脂质稳态丧失、RPE上皮-间质转化、细胞骨架和细胞外基质重塑、分泌改变、脉络膜受累以及Müller胶质细胞功能障碍等多种通路与AMD发病相关。RPE细胞形态和转录异质性的发现提示存在RPE亚群特异性病理，识别与特定AMD亚型相关或对所有AMD类型普遍相关的生物学通路，有助于开发精准治疗和诊断方法。
细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）作为新型液体活检工具受到广泛关注，因其将功能性生物物质包裹在脂质双层囊泡中，反映亲本细胞的代谢状态。RPE细胞以极性方式分泌EV，其分泌模式和囊泡内容在携带遗传易感性或暴露于环境风险因素的AMD-RPE模型中发生改变。向脉络膜侧分泌的EV可进入体循环，使得视网膜疾病特征能够在外周血中检测到。因此，研究血液EV为验证视网膜生物标志物存在于血流中这一假说提供了手段。此外，循环EV可能揭示系统性EV向视网膜递送的过程，该过程理论上可能参与玻璃膜疣形成和AMD发病。本研究旨在通过对30例AMD患者和30例对照者血浆来源EV富集样本进行蛋白质组学、脂质组学和拉曼光谱分析，界定晚期AMD的外周分子特征及相关生物学通路。
**2. 研究方法概述**
研究样本来源于南安普顿大学既往伦理批准研究中收集的30例AMD患者和30例对照者血浆。AMD组包括13例地图样萎缩、5例脉络膜新生血管和12例混合表型。EV富集样本通过差速离心和尺寸排阻色谱法（size exclusion chromatography，SEC）从血浆中分离，并使用透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）和可调电阻脉冲传感（tunable resistive pulse sensing，TRPS）进行表征。采用Western blot验证EV标志物（CD9、CD63）和共分离物（CD41、APOE、APOA1）。蛋白质组学采用数据非依赖采集（data-independent acquisition，DIA）质谱分析，脂质组学采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析，拉曼光谱使用785 nm激发波长的Renishaw inVia Qontor光谱仪采集。生物信息学分析包括基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析、主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和变量投影重要性（VIP）评分。
**3. 研究结果**
**3.1 血浆EV分离物的表征**
TEM显示存在具有典型杯状形态的囊泡。TRPS分析显示平均粒径为160 nm，平均众数为122.6 nm。Western blot证实CD9高表达和CD63存在，验证了血浆EV的成功分离。同时检测到可变的CD41、APOE和APOA1水平，提示存在部分非EV颗粒共分离，因此将分离物称为“EV富集样本”或“细胞外颗粒样本”，符合MISEV2023指南。两组间共分离物丰度无统计学显著差异。
**3.2 血浆EV富集样本的全局蛋白质组学揭示AMD中免疫、氧化还原和蛋白水解失调**
对11例AMD和11例对照血浆EV富集样本进行无标记蛋白质组学分析，每样本鉴定出超过700种蛋白质。PCA显示两组间存在实质重叠，技术重复间Pearson相关系数r＞0.9。共鉴定出122种差异表达蛋白质（倍数变化≥1.5，p≤0.05），其中48种在AMD中显著富集，74种在AMD中耗减。谷胱甘肽过氧化物酶3（GPX3）是AMD中耗减最显著的蛋白质，其他参与铁代谢和抗氧化防御的蛋白质如触珠蛋白（HP）、铜蓝蛋白（CP）、血清转铁蛋白（TF）和血红素结合蛋白（HPX）在AMD中也减少。大量免疫相关蛋白显著降低，包括血浆激肽释放酶（KLKB1）、免疫球蛋白链、补体蛋白（C2、CFB、CFI、C1RL和CFHR1）等。相反，多个参与蛋白质稳态的蛋白质上调，包括泛素-蛋白酶体系统组分（PSMD9、UFC1、RNF8）和应激反应蛋白（HSPB1、STIP1、TXNDC5、GSTM3、CCS）。GO细胞组分分析证实了分离物中EV蛋白的富集。GO生物学过程分析显示AMD中下调蛋白主要富集于凝血和补体系统通路，而上调蛋白富集于组氨酰-tRNA氨酰化、Arf信号转导和解毒通路。GO分子功能分析显示下调蛋白富含内肽酶抑制剂活性，包括丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）蛋白。
**3.3 AMD EV富集样本蛋白质组分析揭示潜在AMD生物标志物的下调**
STRING分析显示仅在下调蛋白中存在强相互作用网络，涉及凝血、补体级联和内肽酶抑制剂通路。多种蛋白为既往研究中提出的AMD生物标志物候选分子，包括SERPINA4（激肽释放素）、SERPINA5、SERPINA7、SERPINF1（色素上皮衍生因子；PEDF）、ITIH2、ITIH1、补体蛋白C1RL、CFHR1、CFI和视黄醇结合蛋白RBP4。PEDF是AMD患者玻璃体中缺乏的强效血管生成抑制剂；激肽释放素是激肽释放酶（KLKB1）的抑制剂，调节血管生成和氧化应激；ITIH2被提出通过细胞外基质重塑作为AMD进展的风险因素。与AMD相关基因的检索鉴定出补体系统的C2、CFI、CFB、CFHR1和F13B。与AMD供体眼RPE-脉络膜和视网膜组织的转录组数据比较，38种显著改变蛋白在转录水平差异表达，其中21种蛋白丰度变化呈正相关，富集于炎症和应激反应、凝血和补体激活通路。Western blot独立验证显示HPX在AMD血浆EV富集样本中显著降低，KLKB1水平在AMD中总体较低但未达到统计学显著。
**3.4 血浆EV富集样本脂质组学提示AMD中鞘脂代谢失调**
对AMD和对照血浆EV富集样本总脂质含量的差异分析鉴定出多种在甘油磷脂、鞘脂和甘油酯中改变的脂质种类，包括磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、神经酰胺、己糖基神经酰胺、鞘磷脂、球三糖神经酰胺、神经节苷脂GA1和GM3、二酰甘油和三酰甘油的多种分子种类。经更严格的双因素ANOVA与?ídák多重比较检验，AMD组中一种三酰甘油种类显著降低，多种鞘磷脂种类显著升高。对CFH rs1061170基因型、HTRA1/ARMS2 rs10490924基因型和吸烟状态进行校正后，三酰甘油TG 54:3和两种鞘磷脂SM 34:1、SM 42:2的显著变化仍存在，而SM 42:3不再显著，表明前者的改变独立于基因型和吸烟效应。总神经酰胺在AMD中显著下调，总鞘磷脂与总神经酰胺比值在AMD中显著升高。这一鞘磷脂-神经酰胺代谢失衡可能反映神经酰胺产生减少和/或鞘磷脂合成速率增加或鞘磷脂分解为神经酰胺减少。
**3.5 拉曼光谱验证AMD全身性氧化应激和脂质代谢失调特征**
对独立队列（10例AMD和10例对照）的血浆EV富集样本进行拉曼光谱分析。比较光谱分析揭示了多个具有统计学显著组间差异的拉曼位移：850 cm?1（酪氨酸/蛋白质侧链）峰强改变提示蛋白质组成变化或氧化修饰；932 cm?1（C–C骨架伸缩，α-螺旋蛋白）的显著差异表明蛋白质二级结构破坏；1000 cm?1（苯丙氨酸环呼吸）反映氨基酸代谢差异；1080 cm?1（PO??对称伸缩，核酸）显著改变提示核酸降解或片段化，与氧化应激一致；1300 cm?1和1445 cm?1（CH?/CH?振动，脂质和蛋白质）表明脂质代谢失调和蛋白质构象破坏；1737 cm?1（C=O伸缩，脂质酯）强度增加提示脂质过氧化或酯化化合物积累。PLS-DA和VIP分析鉴定出前25个对组间分离贡献最大的光谱特征（VIP＞2），热图显示组内聚类和组间分离趋势。AMD组内光谱离散度增加反映了该疾病多因素性质的潜在生化异质性。单个拉曼位移的统计学分析证实932、1080、1300和1445 cm?1峰具有高度显著性差异（p＜0.01），850、1000和1737 cm?1峰具有显著性差异（p＜0.05）。
**4. 讨论与结论**
本研究整合多组学与拉曼光谱鉴定了AMD血浆细胞外颗粒的系统性特征。组学分析证明免疫系统、氧化还原稳态以及蛋白质和脂质代谢的失调，拉曼光谱补充了与氧化应激和脂质失调相关的生化光谱改变证据。这些发现与研究人员先前使用携带补体因子H（CFH）高危多态性的患者特异性AMD RPE模型进行的体外研究一致，该研究揭示了RPE EV介导的信号转导在视网膜微环境中的重要性，并证明AMD RPE EV内容物在遗传、蛋白质组学和脂质组学水平上反映亲本细胞的代谢失调。
关于玻璃膜疣的起源，现有证据支持RPE来源和脉络膜递送的系统性物质共同促成RPE下碎片积聚的情景。人供体玻璃膜疣中鉴定的蛋白质并非RPE或光感受器特异性，也可在血液中找到。炎症相关血浆蛋白（如血清淀粉样P、血清淀粉样A1、血清白蛋白、触珠蛋白1和纤溶酶原）的存在支持体循环可能参与玻璃膜疣形成的观点。慢性低度炎症与AMD患者玻璃膜疣和晚期AMD患病率增加相关。EV/细胞外颗粒聚集可能通过形成病理性钙化物质在此过程中发挥重要作用。
脂质构成玻璃膜疣的第二个主要成分，至少占玻璃膜疣含量的40%。玻璃膜疣中的高脂质浓度可能归因于RPE分泌以及肝源性或肠源性脂蛋白颗粒的滞留。蛋白质组学分析未检测到AMD EV富集制备物中载脂蛋白丰度的统计学显著变化，但该研究的样本制备方案采用SEC旨在耗减脂蛋白携带，结果可能不代表AMD和对照血浆中脂蛋白丰度的定量比较。
拉曼光谱检测到的AMD血浆中蛋白质和脂质的氧化损伤循环化学指纹，与AMD玻璃膜疣、Bruch膜和脉络膜中氧化修饰蛋白质和脂质的特征相似。这一发现与“氧化蛋白质修饰因果参与玻璃膜疣形成”的假说高度一致。研究人员之前已证明氧化应激机制在具有内在脆弱性的培养iPSC-RPE中运作，且AMD iPSC-RPE的“氧化应激”分子特征被包裹在EV中并具有生物学功能。当前研究显示，含有EV和共分离颗粒的外周血浆样本与年龄匹配对照可明确区分，并显示氧化损伤的蛋白质和脂质特征以及保护因子（如GPX3）的耗减。这表明玻璃膜疣积聚和AMD发展可能源于相互关联的过程——固有视网膜易感性和系统性功能障碍。
血浆EV中众多蛋白质（特别是补体蛋白、白蛋白和多数凝血级联蛋白）来源于肝脏。AMD血浆细胞外颗粒中观察到的组成异常可能提示肝脏稳态失调。鞘脂失衡也可能支持肝损伤的可能性。特征为鞘磷脂（SM 34:1）显著升高和神经酰胺降低的鞘脂代谢失调已与肝纤维化相关联。与AMD相关基因的孟德尔随机化研究提出血清鞘磷脂水平升高是AMD的因果性状。鞘磷脂和神经酰胺改变可能通过影响胆固醇稳态、自噬功能障碍和细胞应激对AMD发病产生广泛影响。
研究人员提出AMD中存在支持肝-眼机制联系的三个汇聚点：（1）补体调节——AMD最强的风险因素CFH在肝脏和RPE中均合成；（2）脂质代谢失调和脂蛋白对玻璃膜疣发展的贡献将视网膜病理与肝脏在脂质代谢、脂蛋白和载脂蛋白合成中的角色联系起来；（3）培养AMD iPSC-RPE和AMD血浆细胞外颗粒中血色素结合蛋白丰度的异常将RPE和肝脏中的氧化还原过程和氧化损伤反应联系起来，这两者共同构成体内血色素结合蛋白的主要（“系统性”和“局部”）来源。
本研究的意义与AMD可能是“潜在代谢/血管疾病伴光感受器继发性神经退行性变”的表现的观点一致。高脂“西方饮食”诱导的动物模型AMD样特征以及人群研究结果进一步强化了这一概念。富含亚油酸、单不饱和脂肪、油酸或饱和脂肪的饮食与AMD进展风险增加相关，而地中海饮食和东方饮食模式与AMD发生和进展风险降低相关。地中海饮食（特别是鱼类摄入）与保护性CFH基因型之间的强交互作用凸显了AMD主要遗传决定因素与营养之间的相互作用。
总之，本研究将系统性代谢失衡作为AMD发病的促成因素。研究提供了与既定AMD机制一致的系统性细胞外颗粒特征的新见解，包括蛋白质和脂质代谢失调、氧化修饰以及补体和免疫系统相关的组成异常。这些AMD血浆EV富集样本中的病理相关特征具有作为疾病生物标志物的潜力，支持开发用于早期疾病检测、风险分层和监测高危人群治疗反应的无创液体活检方法。此外，这些发现结合现有文献提示饮食调节可能代表AMD管理中一种可及的辅助策略。该研究发表在《Journal of Extracellular Biology》。
