方法至关重要：基于蛋白质组学的血浆细胞外囊泡分离方法选择框架

《Journal of Extracellular Biology》：Method Matters: A Proteomics-Informed Framework for Selecting Extracellular Vesicle Isolation Methods for Plasma

　　

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为生物标志物具有重要前景，但其临床应用受到前处理和分析前分离变异性的限制。EV分离方法直接决定捕获哪些血浆来源的含EV制备物，然而跨多个分析维度的系统性方法比较仍有限。研究人员在混合乏血小板血浆（platelet-poor plasma, PPP，来自5名供者；每种方法6个技术重复）中全面评估了11种EV分离方法，并使用5名个体供者进一步评估了选定方法。通过NanoFCM对EV进行定量，通过MSD检测分析四旋蛋白（CD9、CD63、CD81），并通过LC-MS/MS蛋白质组学进一步表征。研究表明，用于血浆的不同EV分离方法产生不同的含EV制备物。EV分离方法拓宽了血浆中的蛋白质组覆盖范围，但表现出不同性能。虽然所有方法均捕获了50–150 nm范围内的EV，但离心和超速离心鉴定了最广泛的蛋白质组（高达1093种蛋白质），这是由较高的血浆蛋白携带所致。相反，ExoEasy和qEV 70分离出较大的EV，并实现了对高丰度血浆蛋白更强的去除，但蛋白质组覆盖范围较低。在所有分离方法中总共检测到117种蛋白质。样品的预清除去除了污染物，但以蛋白质鉴定数量为代价。研究人员证明，方法选择必须与特定分析目标保持一致：离心用于全面蛋白质组分析，亲和/尺寸排阻方法用于对污染物敏感的检测，沉淀法用于高通量应用。这项系统表征为将分离策略与下游应用和研究问题相匹配提供了基于证据的框架和查询资源。

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是细胞分泌的膜包裹颗粒，携带蛋白质、核酸等分子货物，在液体活检中具有生物标志物潜力。然而，EVs的临床转化受限于分离方法缺乏标准化。血浆中大量非囊泡污染物（如脂蛋白、蛋白聚集体）可与EVs共分离，不同分离原理（离心、尺寸排阻、沉淀、亲和等）会引入不同偏倚，导致跨研究比较困难。尽管已有方法比较研究，但多局限于少量方法或单一分析维度，缺少基于蛋白质组学的系统评估。因此，研究人员开展了一项系统比较，旨在为不同下游应用提供方法选择的循证框架。该研究成果发表在《Journal of Extracellular Biology》上。

该研究使用了来自健康捐献者（n=10）的血液样本，通过“Giv Blood collaboration”获取，并获得丹麦伦理批准（VEK no. H-D-2007-0055）。研究人员从EDTA、柠檬酸盐和血清等不同采血管制备乏血小板血浆（platelet-poor plasma, PPP），并在混合PPP（来自5名健康捐献者）中评估了11种EV分离方法，每种方法6个技术重复，同时用5名个体捐献者验证了选定方法的供者间变异。主要技术方法包括：基于不同原理的11种EV分离方法（如超滤、亲和、沉淀、尺寸排阻、离心等）；NanoFCM测定颗粒浓度与粒径分布；MSD免疫分析检测四旋蛋白（CD9、CD63、CD81）和血小板标志物CD41a，并通过SDS去污剂处理验证信号是否来自膜囊泡；LC-MS/MS蛋白质组学（Orbitrap Astral MS结合Evosep系统，nDIA模式，Spectronaut分析）用于蛋白鉴定与相对定量；统计分析采用Mann-Whitney U检验并针对多重比较进行Benjamini-Hochberg校正。此外，还系统评估了预分析变量（不同采血方式、预清除步骤、后分离缓冲液交换）对EV组成的影响。

### 3.1 预分析样品制备对EV组成的影响

研究人员比较了不同采血和血浆制备条件（血浆、PPP、血清等）对EV标志物和血小板污染的影响。结果表明，乏血小板EDTA和柠檬酸盐血浆在有效去除血小板标志物CD41a的同时，仍保留EV四旋蛋白信号（CD9、CD63）；而血清中血小板标志物和四旋蛋白信号均未因离心而减少。预清除（0.45 μm过滤和/或12,000 × g离心30 min）可显著降低LC-MS/MS蛋白鉴定数，且未引入独特蛋白，但同时降低了EV相关蛋白强度，提示可能损失部分EV。后分离缓冲液交换（Amicon 100 kDa MWCO）对预清除样本影响较小，但会减少未预清除样本的蛋白鉴定数。

### 3.2 EV特征

通过NanoFCM和MSD检测，11种方法在颗粒产量、粒径和四旋蛋白表达上呈现明显差异。沉淀法（miRCURY、ExoQuick）产量最高（>10¹²颗粒/mL），超速离心最低（约10¹⁰颗粒/mL）。粒径中位数在65–85 nm之间，ExoEasy、miRCURY、qEV 70较大（80–85 nm），超速离心较小（约65 nm）。四旋蛋白分析显示，CD9信号/颗粒比例以离心方法最高，qEV 70最低；CD63和CD81趋势类似，其中CD63在供者间变异较大。SDS去污剂处理可显著降低四旋蛋白信号，但各方法降低幅度不同，确认了信号主要来自囊泡。重现性方面，超速离心最稳定（CV 2%–4%），而Total Exosome Isolation变异最大（CV 6%–39%）。

### 3.3 蛋白质组学

LC-MS/MS蛋白质组学分析显示，离心和超速离心鉴定出最多蛋白（分别约1093和1003种），Total Exosome Isolation最少（161种），其余方法为655–898种，所有方法均超过未分离血浆的487种。方法间蛋白组成差异显著：每种方法均鉴定到独特蛋白集，数量从14种（超滤）到127种（ExoEasy）不等；所有方法共享117种核心蛋白，其中69种注释为“细胞外外泌体”，包括热休克蛋白（HSPA8、HSPA9、HSPD1）、组蛋白和核糖体蛋白。PCA分析显示ExoEasy和qEV 70与其他方法区分明显，而离心方法接近血浆，且PC负荷主要反映免疫球蛋白、补体、凝血和脂蛋白等血浆蛋白，说明差异主要来自血浆蛋白携带。所有方法均富集低丰度蛋白并耗竭高丰度血浆蛋白；离心方法对白蛋白（ALB）、转铁蛋白（TF）等去除能力较弱，而ExoEasy对血浆蛋白的去除最为彻底。在已知EV标志物方面，离心和qEV 70鉴定到最广泛的panel（包括CD81、FLOT1、ALIX、BSG、HSPA8等）。

### 3.4 方法选择的循证框架

研究人员基于蛋白质组深度、纯度、粒径、四旋蛋白密度、颗粒产量、重现性和处理时间等指标，将方法性能汇总并绘制了决策流程图。例如：追求高蛋白质组覆盖时选择离心或超速离心（但需接受较高的血浆背景）；追求高纯度（有效去除血浆蛋白）时选择ExoEasy；追求高通量和高颗粒产量时选择沉淀法（ExoQuick、miRCURY）；而对污染物敏感的应用（如功能学或形态学分析）则建议采用预清除步骤。框架明确指出，方法选择应从“寻找通用最佳方法”转变为“根据具体实验目标匹配最合适的方法”。

讨论部分强调，预分析标准化至关重要，推荐使用乏血小板血浆而非血清，因为血清制备会释放大量血小板来源EV，干扰其他细胞类型的信号。预清除虽然提高了纯度但降低了蛋白鉴定数，因此仅在强调去除污染物时推荐使用。超速离心仍是分离小EV的有效手段，且四旋蛋白信号高，但存在血浆蛋白共沉淀；ExoEasy和qEV 70可分离较大EV并