ALY688通过直接效应和Rab8a依赖性细胞外囊泡减轻心肌缺血-再灌注损伤

《Journal of Extracellular Vesicles》：ALY688 Protects Against Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury via Direct Effects and Rab8a-Dependent Extracellular Vesicles

　　

尽管经皮冠状动脉介入治疗取得了进展，缺血-再灌注（IR）损伤仍然是发病和死亡的主要原因。脂联素具有广泛的心脏保护作用，这推动了脂联素受体激动剂的开发。在此，研究人员研究了ALY688（一种合成的脂联素受体激动剂肽）在心肌IR损伤中的心脏保护功效及其机制。在临床可转化的大鼠IR模型中，缺血期间静脉注射ALY688并联合皮下注射持续28天，可降低肌钙蛋白-I水平、心肌细胞死亡和梗死面积，同时保护心脏功能。ALY688恢复了自噬通量，减轻了活性氧积累，并抑制了IR心脏和缺氧-复氧（HR）处理的心肌细胞中的凋亡。蛋白质组学分析显示，IR下调的Rab8a在ALY688处理后得以维持。值得注意的是，ALY688增加了心肌和血浆中的细胞外囊泡（EV）丰度，且处理动物的EV显示出独特的蛋白质组学特征，富含糖酵解和氧化应激相关蛋白。这些EV对H9c2和人iPSC来源的心肌细胞中HR诱导的损伤具有保护作用。CRISPR介导的Rab8a敲除削弱了ALY688诱导的EV生物发生，并减弱了这些EV的细胞保护作用。综上所述，这些发现确定ALY688是一种有前景的治疗药物，通过直接心肌保护和Rab8a依赖性EV介导的心脏保护信号传导来减轻IR损伤。

**论文解读：ALY688通过直接效应与Rab8a依赖性细胞外囊泡减轻心肌缺血-再灌注损伤**

**一、研究背景与现存问题**

心肌缺血-再灌注（IR）损伤尽管在再灌注治疗方面取得了显著进展，但仍然是全球范围内发病和死亡的主要原因。虽然及时恢复冠状动脉血流对于挽救存活心肌至关重要，但再灌注过程本身会引发一系列有害事件，包括氧化应激、炎症、钙超载和线粒体功能障碍，这些共同导致大量心肌细胞死亡和不良心室重构。据估计，最终梗死面积中高达50%可能归因于再灌注损伤而非最初的缺血性损伤。这一现象不仅限制了当前治疗干预措施的有效性，也凸显了心肌IR损伤作为多因素病理生理过程的复杂性。

近年来，多种调控性细胞死亡通路（如坏死性凋亡、焦亡和铁死亡）被确定为IR损伤后心肌损伤的关键贡献因素。然而，尽管经过数十年的研究和大量有前景的实验策略，心脏保护干预措施从实验台到临床的转化仍然困难重重，这强调了针对IR损伤多种机制的新型多靶点治疗方法的迫切需要。

在众多内源性保护因子中，脂联素（一种脂肪细胞来源的细胞因子）已成为心血管稳态的核心调节因子。大量临床前研究表明，脂联素主要通过激活AMP激活蛋白激酶（AMPK）和环氧合酶-2（COX-2）信号通路发挥强效心脏保护作用，包括减少梗死面积、抑制凋亡以及减轻氧化和炎症应激。在肥胖、糖尿病或已确诊心血管疾病的个体中，脂联素水平通常病理性降低，这种相对脂联素缺乏状态促使了激活脂联素信号传导策略的开发。然而，天然脂联素的临床应用因其复杂的多聚体结构、有限的组织生物利用度和快速的体内清除而受到阻碍。为克服这些限制，研究人员致力于开发小分子或肽类脂联素受体激动剂。ALY688是一种合成的肽类脂联素受体激动剂，在心脏损伤的临床前模型中已显示出强大的心脏保护功效，但其在IR损伤中发挥心脏保护作用的确切分子机制尚未完全阐明。

与此同时，细胞外囊泡（EV）作为心血管疾病中细胞间通讯的关键介质已受到越来越多的关注。EV是由几乎所有细胞类型释放的膜结合颗粒，能够将多种生物活性分子（如蛋白质、脂质和核酸）转移至受体细胞。在心肌IR损伤的背景下，来自心脏保护性细胞类型（如心脏祖细胞或干细胞）的EV已显示出通过传递抗凋亡、抗炎和促再生信号来减轻损伤的作用。值得注意的是，最近的研究揭示脂联素本身可以被包装进EV，且脂联素信号传导可积极促进EV的生物发生和分泌。然而，关于脂联素受体激动剂（如ALY688）如何影响心肌IR损伤中EV的生物发生、货物组成和功能，目前仍缺乏详细描述。

**二、研究内容与主要结论**

研究人员在临床可转化的大鼠IR模型中，通过在缺血期间静脉注射ALY688并联合皮下注射持续给药，系统评估了ALY688对心脏功能、心室重构以及细胞死亡、氧化应激和自噬的影响。研究发现，ALY688干预显著减轻了IR引起的心脏功能障碍，表现为射血分数（EF）和缩短分数（FS）的下降得到明显缓解，梗死长度减少，整体心肌厚度增加。ALY688还显著降低了循环中肌钙蛋白-I和乳酸脱氢酶（LDH）水平，减少了TUNEL阳性凋亡细胞数量。在体外缺氧-复氧（HR）模型中，ALY688预处理显著降低了H9c2细胞和人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CM）的细胞死亡、活性氧（ROS）积累和DNA氧化损伤。机制研究表明，ALY688恢复了IR/HR紊乱的自噬通量，减少了LC3-II的异常积累，增加了溶酶体活性。通过心脏组织蛋白质组学分析，研究人员发现Rab8a（一种在IR中下调的小GTP酶）在ALY688处理后恢复至基线水平。ALY688增加了心肌和血浆中EV的丰度，且处理动物的EV显示出独特的蛋白质组学特征，富含糖酵解和氧化应激相关蛋白。功能实验证实，来自ALY688处理动物的血清EV可减轻HR诱导的心肌细胞损伤和ROS积累。CRISPR介导的Rab8a敲除（RKO）削弱了ALY688诱导的EV生物发生，并减弱了这些EV的细胞保护作用，表明Rab8a是ALY688衍生EV促生存功能的关键介质。该研究发表在《Journal of Extracellular Vesicles》。

**三、主要技术方法**

研究人员采用了大鼠左前降支冠状动脉（LAD）结扎45分钟再灌注的IR模型，并设置假手术、IR、缺血期给药（IR-AI）和再灌注期给药（IR-AR）组，通过尾静脉注射联合皮下注射给予ALY688ER（10 mg/kg），持续2天（急性）或28天（慢性）。主要技术方法包括：超声心动图评估心脏功能；组织学分析（H&E、Masson Trichrome、TUNEL染色）评估梗死面积和细胞凋亡；LC-MS/MS蛋白质组学分析（S-TRAP和FASP法）对心脏组织和血浆EV进行蛋白质组学分析；纳米颗粒跟踪分析（NTA）和冷冻电子显微镜（Cryo-EM）表征EV；CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Rab8a敲除H9c2细胞；Seahorse细胞外通量分析仪评估线粒体功能；活细胞荧光显微镜和流式细胞术等。

**四、研究结果**

**4.1 ALY688干预减轻IR诱导的心脏功能障碍**

通过超声心动图评估，IR组大鼠的EF和FS较假手术组显著降低，而ALY688治疗显著减轻了这一下降，表明收缩功能得到保护。无论ALY688在缺血期给药还是在再灌注时开始给药，功能改善程度相似。ALY688还导致梗死长度显著减少，梗死区域整体心肌厚度增加，表明不良心室重构得到减轻。

**4.2 ALY688对IR后细胞死亡、氧化应激和自噬的影响**

IR显著增加了肌钙蛋白-I和LDH水平，而ALY688治疗显著降低了这些水平。TUNEL染色显示ALY688减少了IR诱导的凋亡细胞。在体外HR模型中，ALY688预处理减少了H9c2细胞和iPSC-CM的LDH释放、caspase 3/7活化和细胞死亡。ALY688还减弱了HR诱导的ROS产生和8-OHdG表达的DNA氧化损伤。在自噬方面，IR/HR心脏和细胞中LC3-II和p62水平异常升高，而ALY688部分减轻了这种异常积累。通过活细胞自噬报告系统和多种荧光探针（HiBiT-LC3、MagicRed、DapRed、DalGreen和tandem GFP-RFP-LC3）的实时分析证实，ALY688恢复了HR紊乱的自噬通量，增加了溶酶体活性和自溶酶体数量。

**4.3 心肌梗死区域组织蛋白质组学分析**

PLS-DA和层次聚类分析显示假手术、IR和IR-AI组之间蛋白质表达谱存在显著差异。IR与心脏重构相关的通路激活有关，包括细胞外基质、胶原沉积、代谢紊乱和炎症激活。ALY688处理改变最显著的通路是脂联素样（自噬）信号通路，以及代谢和炎症通路。火山图分析强调Rab8a在IR中显著下调，而ALY688处理将其恢复至基线水平，并通过Western blot验证。

**4.4 IR大鼠血清来源EV的表征**

通过扫描电子显微镜（SEM）观察到梗死心肌中EV积聚，ALY688给药后梗死区域颗粒丰度较IR对照组更高。通过尺寸排阻色谱（SEC）分离的血清EV，NTA分析显示IR大鼠EV水平有降低趋势，部分被ALY688恢复。Cryo-EM确认了EV的脂质双层和电子致密货物。EV阳性表达Alix、CD63和Flotillin1，且Rab8a存在于血清EV中，其在EV中的表达模式与在梗死心脏组织中观察到的IR和ALY688处理后的情况一致。

**4.5 ALY688通过Rab8a激活调节心肌细胞EV介导的促生存效应**

来自IR-AI大鼠的血清EV（EVIR-AI）显著降低了HR诱导的两种细胞类型的细胞死亡和ROS积累。使用Dynasore（dynamin GTPase抑制剂）阻断EV内吞后，EVIR-AI的LDH降低效应被消除，表明EV的物理内化是细胞保护所必需的。使用GW4869（nSMase2抑制剂）抑制受体细胞的内源性EV生物发生并未改变EVIR-AI的保护作用，表明保护作用归因于外源性递送的ALY688重编程EV货物。在Rab8a敲除（RKO）H9c2细胞中，ALY688诱导的EV分泌显著低于野生型（WT）细胞，且来自RKO细胞的ALY688处理EV未能保护HR诱导的细胞死亡和ROS积累，证明Rab8a是ALY688衍生EV促生存功能的关键介质。

**4.6 ALY688干预大鼠血清来源EV发挥心脏保护代谢效应**

血清EV蛋白质组学分析鉴定出247种蛋白，其中多种蛋白在IR后的EV中显著上调，而在IR-AI与IR比较中下调蛋白多于上调蛋白。IR-AI EV中糖酵解酶（如GAPDH、PKM和PGK1）和ER应激调节因子GRP78的表达下调。Seahorse分析显示EVIR-AI改善了HR诱导的受损能量代谢。HR破坏了肌动蛋白细胞骨架结构，而EVIR-AI保护了肌动蛋白丝的完整性。EVIR-AI处理还恢复了HR诱导的ATF4、GRP78和Tuba4a蛋白表达下降。EVWT-ALY（而非EVRKO-ALY）保护了HR刺激的心肌细胞的细胞骨架完整性和线粒体网络结构。组织水平Western blot验证了糖酵解酶（PGK1、PKM）在IR心脏中升高而IR-AI恢复，细胞骨架蛋白（Talin1、Tuba4a、Actg1）在IR中降低而Talin1和Actg1在ALY688处理后恢复。

**五、讨论与结论**

本研究发现合成的脂联素受体激动剂肽ALY688提供了强大的心脏保护作用，改善了左心室功能，减少了梗死面积并限制了重构。ALY688的保护作用部分通过恢复自噬通量、减少ROS积累和抑制凋亡实现。机制上，ALY688恢复了IR中下调的Rab8a表达，进而增强EV的生物发生和分泌。ALY688重编程的EV通过下调糖酵解酶、恢复细胞骨架完整性、减轻ER应激和改善线粒体功能，在受体心肌细胞中发挥促生存效应。该研究将EV确定为脂联素受体介导的心肌IR损伤保护的一个重要且此前未被识别的机制。ALY688的双重作用（直接心肌保护与系统性EV介导效应）及有利的药代动力学特性，使其成为急性心肌梗死及其他以IR损伤为特征的心血管疾病临床转化的有前景候选药物。研究局限性包括：Rab8a在体内的作用需使用心肌细胞特异性敲除模型验证；EV货物蛋白质组学分析未区分外泌体和微泡亚群；未评估ALY688-EV对心脏重构和功能的长期效应。未来研究需确定脂联素诱导的EV是否具有独特的分子特征，以及Rab8a上调是否能增强缺血心肌中EV的摄取和治疗效果。