《Journal of Extracellular Vesicles》：Host-to-Pathogen Transfer of Neutrophil Components via Extracellular Vesicles Shields Candida albicans From Immune Attack in Human Blood
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中性粒细胞能有效清除人血液中的白色念珠菌（Candida albicans），但部分真菌细胞可逃避免疫清除并保持胞外存活状态。研究人员发现，这种逃逸不依赖白色念珠菌已知的免疫逃逸特征，而是由富含抗微生物蛋白和中性粒细胞表面标志物（CD66b、CD45、CD63
中性粒细胞能有效清除人血液中的白色念珠菌（Candida albicans），但部分真菌细胞可逃避免疫清除并保持胞外存活状态。研究人员发现，这种逃逸不依赖白色念珠菌已知的免疫逃逸特征，而是由富含抗微生物蛋白和中性粒细胞表面标志物（CD66b、CD45、CD63及补体受体CR1、CR3和CR4）的中性粒细胞源性细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）所促进。分离的EVs以补体依赖性方式优先结合白色念珠菌，该结合可被抗CD11b抗体部分抑制，提示CR3参与其中。尽管EVs携带抗微生物货物，但并未损害真菌生长。相反，EV包被在纯化细胞和全血环境中均降低了中性粒细胞的吞噬作用。这些发现揭示了中性粒细胞源性EVs在宿主-病原体界面的双重作用：尽管其富集具有潜在抗真菌活性的先天效应分子，但这些EVs在白色念珠菌表面的沉积并不抑制其生长，反而与吞噬作用减弱及胞外真菌群体的维持相关。
中性粒细胞源性细胞外囊泡促进白色念珠菌免疫逃逸的机制研究——论文解读
白色念珠菌（Candida albicans）是侵袭性真菌感染最常见的病原体之一，已被世界卫生组织列为关键优先真菌病原体。中性粒细胞是人体血液中清除该菌的核心效应细胞，主要通过吞噬、脱颗粒、氧化爆发和中性粒细胞胞外诱捕网等机制抑制真菌生长。然而，既往研究发现，在人类全血感染模型中，尽管大部分白色念珠菌被中性粒细胞和单核细胞快速吞噬，仍有约15%的真菌细胞持续存在于细胞外，且这一现象不依赖真菌的活性或形态转换能力。这种“逃避”现象的宿主机制长期未被阐明。为此，研究人员开展本研究，旨在探索宿主因素是否通过某种方式降低了中性粒细胞对白色念珠菌的吞噬清除效率。
研究人员利用健康志愿者外周血样本（来自耶拿大学医院和维尔茨堡大学医院伦理委员会批准的采集方案），通过全血感染模型、中性粒细胞纯化共培养体系、细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）分离与表征、蛋白质组学分析、流式细胞术、成像流式细胞术、激光共聚焦显微镜、活细胞成像以及数学建模等手段，系统揭示了中性粒细胞源性EVs在白色念珠菌免疫逃逸中的作用。主要技术方法包括：使用重组水蛭素抗凝全血进行离体感染，利用MACSxpress试剂盒分离原代中性粒细胞，通过差速离心和过滤从共培养上清中纯化EVs，采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）和冷冻透射电镜（cryo-TEM）鉴定EVs形态与粒径，使用Western blot和LC-MS/MS进行蛋白质组学分析，并通过流式细胞术和成像流式细胞术检测真菌表面标志物及吞噬比例。数学建模采用基于状态的虚拟感染模型结合近似贝叶斯计算（ABC）量化吞噬速率变化。
研究结果部分主要包含以下发现：
**3.1 细胞外白色念珠菌保持活力并获得中性粒细胞标志物CD66b**：通过全血感染实验和流式细胞分选，研究人员发现灭活的或非菌丝突变体（cph1Δ/efg1Δ）的细胞外存活比例与野生型活菌相似，且大多数细胞外真菌经碘化丙啶染色呈阴性，表明它们未被胞外杀伤机制清除。进一步分析显示，细胞外真菌表面CD66b的表达随时间显著增加，提示宿主来源的中性粒细胞组分沉积于真菌表面。
**3.2 中性粒细胞将宿主细胞分子装饰于白色念珠菌表面**：在中性粒细胞与调理后的真菌共培养体系中，研究人员通过流式细胞术检测到细胞外真菌表面出现CD66b、CD45、CD11b、CD63等中性粒细胞标志物，而CD88未检出。Annexin V染色阳性提示膜性结构结合于真菌表面。同时，中性粒细胞凋亡比例仅约10%，排除了凋亡小体为主要来源的可能性。
**3.3 暴露于白色念珠菌增强中性粒细胞EV释放**：通过NTA检测，研究人员发现与调理后的白色念珠菌共培养后，中性粒细胞释放的EVs（CaEVs）浓度显著高于自发释放的EVs（SponEVs），粒径分布约100–200 nm。cryo-TEM确认了球形、具有完整双层膜结构的囊泡形态。Western blot证实CaEVs表达CD11b、CD63和Annexin A1，且缺乏内质网蛋白Calnexin和线粒体蛋白Cytochrome c，表明EVs纯度较高。
**3.4 真菌刺激驱动中性粒细胞源性EV蛋白质组的定量与定性变化**：LC-MS/MS蛋白质组学分析显示，CaEVs和SponEVs共享470种核心蛋白，而CaEVs独有231种蛋白。核心蛋白包含多种中性粒细胞表面标志物和补体受体（CR1、CR3、CR4）。通路富集分析显示，CaEVs中丰度最高的50种蛋白显著富集于“中性粒细胞脱颗粒”通路，包括髓过氧化物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（ELANE）、组织蛋白酶G（CTSG）、乳铁蛋白（LTF）、溶菌酶（LYZ）等抗微生物蛋白，其中多种蛋白在CaEVs中较SponEVs显著上调。
**3.5 CaEV相关髓过氧化物酶具有酶活性**：通过TMB比色法，研究人员在完整CaEVs中检测到MPO活性，且在囊泡裂解后活性显著升高，证实EVs携带的抗菌酶仍具催化功能，但大部分酶可能在完整囊泡内不易接触底物。
**3.6 中性粒细胞源性EVs结合于白色念珠菌表面并转移宿主标志物**：将荧光标记的CaEVs与调理后的真菌共孵育后，成像流式细胞术和共聚焦显微镜均观察到真菌表面形成点状荧光结构。流式细胞术检测到真菌表面出现CD66b、CD11b、CD45、CD63等标志物，而未经EV处理的对照真菌无此信号，证明EVs可直接结合真菌并转移宿主蛋白。
**3.7 补体调理促进EVs与白色念珠菌结合**：与未经补体调理的真菌相比，预调理（C3b/iC3b阳性）的真菌与EVs结合显著增强。用抗CD11b中和抗体预孵育EVs可部分抑制其与真菌的结合，表明EVs表面的补体受体CR3（CD11b/CD18）参与识别调理后的真菌。此外，EVs也能与未调理真菌发生较低程度的结合，提示其他分子机制也可能参与。
**3.8 EVs降低中性粒细胞对白色念珠菌的吞噬作用**：活细胞成像显示，CaEVs处理不影响真菌的菌丝生长。然而，经CaEVs预孵育的灭活真菌（EVC.a.）在纯化中性粒细胞体系中的胞外比例较对照增加约60%，在全血感染中也增加了约57%。数学建模结合ABC参数推断显示，EV修饰真菌的吞噬速率（0.053 min?1）较未处理对照（0.086 min?1）降低约1.6倍。
讨论部分指出，该研究揭示了一种完全由宿主驱动的免疫逃逸机制，不同于白色念珠菌已知的主动免疫逃逸策略。中性粒细胞源性EVs表面携带补体受体和黏附分子，能够以补体依赖方式结合到真菌表面，形成一层宿主来源的“外衣”。尽管EVs富含抗微生物蛋白，但其完整囊泡结构可能限制了这些酶的接触和作用，因此不表现直接杀菌活性。相反，EV包被可能通过空间掩蔽真菌的病原体相关分子模式（PAMPs）和补体调理素（如C3b/iC3b），减少吞噬细胞的识别；同时，向真菌表面转移宿主膜蛋白可能产生“自我”样信号，干扰吞噬细胞对非我的判别。该机制可能导致血液中持续存在具有活力的细胞外真菌群体，为播散性感染创造条件。
研究结论可总结为：中性粒细胞源性EVs通过补体依赖性方式结合至白色念珠菌表面，降低真菌对吞噬摄取的易感性。这一发现扩展了中性粒细胞EVs的功能谱，揭示了一种宿主来源的、可调节免疫识别并促进真菌在血液中持续存活的机制，为理解血流感染中宿主-病原体相互作用提供了新视角。该论文发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。
