麻醉大鼠梗死周围区长时程增强受损提示卒中后恢复的替代机制

《The Journal of Physiology》：Impaired peri-infarct long-term potentiation in anaesthetized rats suggests alternative mechanisms of post-stroke recovery

　　

摘要

卒中后早期，梗死周围皮质处于高可塑性时期，这一现象被认为通过长时程增强（long-term potentiation, LTP）表达的增强为功能性运动恢复提供生理基础。既往关于卒中后LTP诱导能力的脑片电生理研究结果相互矛盾。脑片制备过程可能通过破坏卒中后已知发生改变的神经调质过程而影响实验结果。因此，梗死周围皮质能否诱导LTP仍有待阐明。在本研究中，研究人员在乌拉坦麻醉的15只大鼠（其中11只接受初级运动皮质局灶性卒中建模，4只为假手术对照）中评估了突触传递、短时程可塑性及以诱发电位场电位增加为操作性定义的LTP。大鼠在卒中后一周或两周接受测试，采用在 na?ve 大鼠中验证的微扰最小化在体LTP诱导方案。运动功能在基线和卒中后一周或两周时通过圆柱筒测试进行评估。结果显示，与假手术大鼠相比，M1梗死周围皮质的LTP诱导能力显著降低。此外，较高刺激强度下的突触传递减弱，短时程可塑性由易化转为抑制，提示卒中后一周和两周时突触功能受损。在行为学层面，受损大鼠在卒中后一周表现出运动缺陷，但在卒中后两周显示出完全恢复。结果表明，在M1卒中后的运动恢复期间，梗死周围皮质的LTP和突触传递均受到严重损害。

**论文解读：麻醉大鼠梗死周围区长时程增强受损提示卒中后恢复的替代机制**

**一、研究背景与目的**

卒中后早期存在一个自发恢复的时间窗口，在此期间动物和人类均表现出对训练的高度响应性。这种时间有限的恢复能力增强现象，传统上被归因于梗死周围区域可塑性的短暂升高，特别是通过长时程增强（long-term potentiation, LTP）表达的增强来实现。LTP是一种与学习和记忆存在因果联系的突触可塑性机制（Nabavi et al., 2014; Rioult-Pedotti et al., 2007），通过稳定新生突触和增强突触传递，在结构和功能突触变化之间建立生理桥梁（Hill & Zito, 2013; Rioult-Pedotti et al., 1998）。

然而，关于卒中后LTP是否得以保留的争论始终悬而未决。Hagemann等人于1998年的开创性工作首次报道了在大鼠感觉运动皮质梗死周围区域脑片制备中观察到LTP增强现象（Hagemann et al., 1998）。但后续在海马脑片中的研究却提供了相反的证据，显示LTP诱导能力降低（Li et al., 2013; Orfila et al., 2019）。这种矛盾可能源于脑片制备方法本身的局限性——该方法在制备过程中会破坏已知在卒中后被改变的神经调质过程，特别是γ-氨基丁酸能（GABAergic）抑制系统和多巴胺能系统。

越来越多的证据表明，腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）向初级运动皮质（primary motor cortex, M1）的多巴胺能投射在增强M1兴奋性、驱动LTP和运动学习中发挥关键作用（Molina-Luna et al., 2009; Li et al., 2017; Kunori et al., 2016），提示VTA–M1通路可用于在更接近生理条件的制备中研究LTP。基于上述背景，本研究旨在开发一种保留内源性抑制张力和神经调质输入的微扰最小化在体制备方法，通过汇聚性VTA–M1联合激活诱导LTP，无需药理干预，并利用该方案检验以下假说：在乌拉坦麻醉大鼠中，卒中后梗死周围M1区域能够诱导LTP。

**二、主要技术方法**

本研究涉及两项连续实验。实验1在44只 na?ve Sprague–Dawley大鼠中开发并验证M1皮质LTP在体诱导方案，通过随机分组比较M1单独θ爆发刺激（theta burst stimulation, TBS）、VTA单独强直-时相刺激以及VTA–M1配对联合刺激三种方案的效果。实验2在36只大鼠中采用内皮素-1（endothelin-1, ET-1）局灶注射于前肢M1区域建立局灶性缺血性卒中模型（该模型通过多血管收缩产生局灶性短暂缺血性卒中并伴随再灌注和半暗带），在假手术组、卒中后一周组和卒中后两周组中评估LTP诱导。电生理记录包括输入-输出（input-output, IO）曲线评估突触招募范围、双脉冲比率（paired-pulse ratio, PPR）评估短时程可塑性，以及fPSP峰值振幅的时程变化评估LTP。LTP定义为刺激方案应用后30分钟fPSP峰值振幅的持续增加。运动功能通过圆柱筒测试评估。实验中，同心双极刺激电极分别植入M1和VTA，玻璃记录电极置于M1皮质II/III层；VTA–M1配对方案以M1 TBS（10串5 Hz刺激，每串含4个100 Hz脉冲，每10秒重复一次）与VTA刺激（4 Hz强直刺激2秒，前后各伴随2秒20 Hz时相刺激）同步进行。整个实验中不使用GABA受体拮抗剂。招募的大鼠采用乌拉坦（1.75 g/kg腹腔注射）麻醉。

由于实验技术难度较高（电极断裂、早期死亡、不可控出血等），实验1和实验2分别排除了20只和21只大鼠。实验2最终纳入15只大鼠（4只假手术、6只卒中后一周、5只卒中后两周）。所有最终数据分析均对实验分组设盲。此外，研究还通过尼氏染色、Cavalieri公式进行卒中体积测量，并通过Fisher精确检验、χ2检验、线性混合效应模型等统计方法分析数据。

**三、研究结果**

**1. 同时激活VTA–M1是乌拉坦麻醉下在体诱导M1 LTP的必要条件**

在 na?ve 大鼠中，只有VTA–M1配对联合刺激方案能够诱导显著的LTP（达基线值的114.72 ± 11.93%），而M1单独刺激或VTA单独刺激均不能改变突触强度。配对方案使fPSP振幅从基线增加0.41个标准差（95% CI [0.18, 0.64]），且该效应显著大于单独激活M1或VTA时。三组间基线突触传递、阈值刺激强度和基线刺激强度均无差异。

**2. 卒中后运动功能短暂受损**

ET-1诱导的卒中导致短暂的行为相关缺陷：卒中后一周时，探索行为（圆柱筒接触次数）和病灶对侧前肢使用率显著降低；卒中后两周时，两项指标均恢复至卒中前水平。假手术组各时间点均无显著变化。纳入与排除大鼠之间的行为指标无差异，排除了抽样偏倚。

**3. 卒中后梗死周围M1皮质LTP诱导受损**

采用配对VTA–M1刺激方案，在后卒中一周和两周的卒中大鼠梗死周围区域，LTP诱导显著受到抑制。假手术组表现出明显的LTP（基线值的127 ± 10.21%），而卒中后一周组fPSP振幅显著降至基线值的73.28 ± 25.55%，卒中后两周组fPSP振幅为基线值的79.83 ± 26.42%。标准化模型参数确认：与假手术组相比，卒中后一周LTP诱导效应减少1.21个标准差（95% CI [?1.75, ?0.66]），卒中后两周减少0.95个标准差（95% CI [?1.51, ?0.38]）。

**4. 假手术大鼠无选择偏倚**

通过比较纳入与排除的假手术大鼠，发现阈值强度、基线强度和IO曲线均无显著差异，证明高流失率未在假手术组中引入抽样偏倚。假手术组LTP效应量与na?ve VTA–M1组相当（0.44 ± 0.2 vs. 0.57 ± 0.44，r = 0.147，P = 0.683），表明假手术后VTA–M1方案的效应得以保留。

**5. 卒中后突触传递和短时程可塑性受损**

卒中后PPR进行性降低，卒中后两周时与假手术组差异显著（H? = 7.44，P = 0.0243），且PPR显著低于1（V = 5，P = 0.0312），提示短时程可塑性从易化逐渐转变为抑制。IO曲线分析显示卒中后突触招募受损：假手术组在2×阈值刺激强度时fPSP振幅已显著增加，而卒中后一周组需要在4×阈值强度才出现显著差异，卒中后两周组即使5×阈值强度也未检测到显著增加。标准化参数分析表明，卒中后特别是较高刺激强度下fPSP振幅相对于假手术组显著减小。

**6. LTP能力与卒中体积或运动缺陷无相关性**

卒中体积在卒中后一周组和两周组之间无显著差异（38.22 ± 39.3 mm3 vs. 9.14 ± 2.35 mm3，W = 21，P = 0.0952）。LTP能力（fPSP振幅变化百分比）与卒中体积（Spearman's rho = ?0.2，P = 0.584）及残余运动缺陷（Spearman's rho = ?0.15，P = 0.654）均无显著相关性。

**四、研究结论**

本研究结果表明，在M1卒中后运动恢复的关键时期，梗死周围皮质的突触传递和LTP均受到严重损伤。尽管LTP对于运动技能学习是必要的，但结构性可塑性和LTP是独立机制。研究人员提出，卒中后早期梗死周围区域的结构性过度可塑性无法支持由学习诱导的功能改善；相反，它可能反映了一个无法支持LTP诱导的不稳定环境。LTP诱导的缺陷可为卒中后特定形式学习受损提供解释。这些结果与一种新兴框架一致，即恢复依赖于网络动力学的重建，而非通过遗传、细胞和功能变化的整合级联实现的局部突触再连接。研究强调最佳功能性大脑状态的存在，超出其上下限，LTP等核心神经特征将无法维持，而恢复这种临界状态可能对运动恢复至关重要。（约1580字）