《Molecular Ecology Resources》：Target Capture of Ancient Shell DNA Enables Phylogenetic Reconstruction of Deep-Sea Molluscs
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靶向捕获技术广泛应用于富集脊椎动物磷酸钙骨骼材料中的内源DNA，但其在无脊椎动物广泛产生的碳酸钙硬体上的表现仍知之甚少。本研究比较了4个新鲜和12个古代（其中8个经放射性碳定年为距今1671–1135年）深海囊鳃蛤科（Vesicomyidae）贝壳的DNA回收
靶向捕获技术广泛应用于富集脊椎动物磷酸钙骨骼材料中的内源DNA，但其在无脊椎动物广泛产生的碳酸钙硬体上的表现仍知之甚少。本研究比较了4个新鲜和12个古代（其中8个经放射性碳定年为距今1671–1135年）深海囊鳃蛤科（Vesicomyidae）贝壳的DNA回收效率，涉及物种包括Archivesica marissinica、A. nanshaensis和A. okutanii，采用全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）或超保守元件（ultraconserved elements, UCEs）靶向捕获策略。WGS从新鲜软组织中获得了16.65%的UCE靶向读取率，但在贝壳样本中低于1%。相比之下，同一标本的UCE捕获使靶向读取增加高达155倍，在新鲜贝壳中达到29.84%，在古代贝壳中提高达72倍，达到19.89%。UCE靶向捕获每个样本回收了142–1001个位点，而单独使用WGS仅回收0–230个位点。基于bwa-mem2和bbmap比对读取，A. marissinica和A. okutanii的古代贝壳表现出典型的死后DNA损伤信号，其5′端C-to-T错配率平均值分别为3.46%和15.97%，超过了新鲜A. marissinica贝壳中观察到的水平（最大1.24%）。基于UCE的系统发育重建结合贝壳古代DNA，恢复了Pliocardiinae亚科内的两个主要支系，与已发表的系统发育基因组学树一致。综上所述，这些发现表明靶向捕获富集技术能够有效回收高度降解的古代软体动物贝壳DNA，并支持属内尺度的稳健系统发育推断，拓展了贝壳——无脊椎动物最丰富的遗存之一——在进化、生物地理和保护研究中的应用潜力。
**论文解读：基于UCE靶向捕获的古代贝壳DNA研究——以深海囊鳃蛤为例**
**一、研究背景与科学问题**
古基因组学在脊椎动物研究中已成为常规手段，可从前骨和牙齿中获取全基因组规模数据，但海洋无脊椎动物庞大的生物档案资源仍相对未充分开发。软体动物贝壳在考古和化石记录中极为丰富，是古环境定年、温度和盐度重建的重要替代指标。贝壳形成过程中，内源DNA可掺入晶体内和晶体间的有机基质中，其中晶体内组分不易受成岩作用降解，为研究过去提供了更可靠的分子窗口。然而，提取这类基因组信息面临严峻的技术挑战：与能有效保存DNA的致密脊椎动物骨骼不同，软体动物贝壳由95%–99%的碳酸钙组成，仅含1%–5%的有机基质，导致内源DNA产量极低。早期贝壳DNA研究主要局限于通过PCR扩增短片段进行物种鉴定，未能充分发挥贝壳DNA在生态和进化推断中的巨大潜力。近年来，高通量全基因组测序被应用于历史和古代贝壳以绕过PCR的局限，但由于内源DNA含量低，WGS在贝壳基质上的应用成本高昂且回收信息性核位点的效率极低。
靶向捕获测序基于Illumina测序平台，在处理高度降解样本方面已广受欢迎，如历史博物馆样本（约100–500年前）和古代遗存（超过1000年前）。然而，其在海洋生物中的应用极为罕见。迄今为止，仅有一项研究将靶向捕获应用于软体动物旧贝壳，从长达60年的鲍鱼壳中回收了线粒体基因组。该研究证明了靶向捕获方法的可行性，但其在古代贝壳上的有效性仍未得到验证。亚化石生物矿物（约1000–10000年前）与博物馆收藏品相比经历了截然不同的保存条件，但往往是解决珍稀谱系进化历史的原始生物档案或唯一可获取材料。
深海囊鳃蛤（Venerida: Vesicomyidae）是深海化能合成生态系统（如热液喷口和烃类渗漏）中最占优势的动物类群之一。然而，Pliocardiinae亚科内类群的进化关系因活体材料采样稀疏而存在争议，一些物种仅从空壳中得知。全基因组规模核数据是解析此类谱系系统发育的关键，但对许多分类群仍不可得。前期工作凸显了WGS在贝壳古代DNA研究中的局限性——对三对约1500年前的A. nanshaensis贝壳进行测试仅回收了12个线粒体重叠群和2913个核重叠群。因此，亟需开发更高效、更具靶向性的方法。
超保守元件杂交捕获是一个有吸引力的解决方案。UCEs在不同进化尺度上具有适用性，近期已为双壳类开发了探针组，显示出对现代组织样本的高跨分类群转移性。本研究将UCE靶向捕获与古代DNA相结合，利用“Bivalve UCE 2k v.1”探针组（捕获约2000个UCE位点）对三种囊鳃蛤物种经放射性碳定年的古代贝壳进行测试，旨在比较UCE捕获与WGS在A. marissinica贝壳上的效率，表征不同深海环境（渗漏vs.喷口）的死后损伤模式，并评估贝壳来源位点的系统发育效用。
**二、主要技术方法**
研究人员采用了以下关键技术方法：（1）从南海海马冷泉、日本相模湾初島冷泉、南海北部无名非活跃冷泉及冲绳海槽Sakai热液喷口等深海环境采集样本，其中4对新鲜贝壳和9枚古代贝壳分别储存于不同温度条件下，4枚A. marissinica和2枚A. okutanii贝壳经加速器质谱（AMS）进行放射性碳定年；（2）对新鲜和古代贝壳分别进行DNA提取，采用靶向捕获测序和全基因组测序两种策略比较DNA回收效率，其中6个DNA文库应用Bivalve UCE 2k v.1探针组进行超保守元件富集；（3）应用bwa-mem2和BBMap两种比对策略将读取映射至A. marissinica核基因组和线粒体基因组参考序列；（4）使用PMDtools进行DNA损伤分析；（5）采用从头组装和参考引导组装策略进行数据组装，利用PHYLUCE提取UCE位点；（6）基于UCE和线粒体基因构建多个系统发育矩阵，使用IQ-TREE2进行最大似然法系统发育推断。
**三、研究结果**
**3.1 放射性碳定年、测序产量和比对结果**
放射性碳分析确认了A. marissinica和A. okutanii的旧贝壳为古代材料，A. marissinica四枚贝壳的校正年龄可追溯至距今1812–1160年，与A. nanshaensis（1618–1340年BP）相当，但老于A. okutanii（1326–1001年BP）。δ13C值接近零表明贝壳形成碳源明显不同于甲烷来源的溶解无机碳，因此14C定年不受死碳效应干扰。在A. marissinica中，新鲜贝壳比古代贝壳产生更多的核映射读取（0.74–2963万 vs. 0.40–531万）和线粒体读取（59–39281 vs. 20–1070）。WGS测序数据中，新鲜贝壳的映射读取百分比显著高于古代贝壳（p<0.05）。UCE捕获数据集比WGS数据显示出更高的核读取重复率（69.11%–98.76% vs. 12.3%–33.98%）。
**3.2 UCE靶向捕获效率评估**
研究人员以A. marissinica软组织和贝壳（靶向1627个UCE位点，总计1,547,522 bp）比较了靶向捕获效率。WGS在新鲜贝壳中仅回收0.19%–0.97%的UCE靶向读取，在古代贝壳中回收0.009%–0.18%。相比之下，UCE捕获在新鲜贝壳中实现20.38%–29.84%的靶向率，在古代贝壳中实现0.45%–19.88%的靶向率（较低输入量）。与WGS相比，靶向捕获显著富集了古代贝壳样本的UCE靶向读取（中位数：5.78% vs. 0.06%，p<0.05）。富集效率为同一样本WGS数据的26–155倍，但重复率增加（85.80%–98.20% vs. WGS中的25.90%–80.40%），古代贝壳10×深度覆盖率提高（1.16%–23.64% vs. WGS中的0.12%–7.21%）。
**3.3 组装结果**
每个贝壳测序数据生成从头组装和参考引导组装后合并去冗余。每个数据集共产生65,790–149万个总重叠群，平均仅14.18%归类为目标核重叠群。古代贝壳产生大量总重叠群但目标核重叠群较少（145–403,175个），少于新鲜贝壳（15,388–565,073个）。在线粒体组装方面，WGS数据从所有新鲜A. marissinica贝壳中恢复了完整的37个线粒体基因，而UCE捕获数据集仅获得部分线粒体组装（1–20个基因片段）。大多数古代贝壳回收的线粒体基因片段少于新鲜贝壳。值得注意的是，来自海马冷泉的A. marissinica（Amar6和Amar10）和来自相模湾渗漏的A. okutanii（Aoku2）保存条件较好，获得了接近完整的线粒体基因组。
**3.4 深海鲜贝壳的DNA损伤分析**
研究人员使用PMDtools分析核苷酸错配模式，发现内源读取大多超过100 bp，但靶向捕获富集后短读取（<100 bp）增多。新鲜贝壳在WGS和UCE捕获数据集中均表现出极小的末端损伤（5′端C-to-T错配最大1.24%）。古代贝壳DNA损伤水平升高，使用bwa-mem2比对和bbmap比对读取的平均5′端C-to-T错配率分别为3.46%和15.97%。喷口环境贝壳Aoku1表现出高脱氨信号（bbmap映射读取C-to-T为35.65%），且内源产量降低（仅3993个核重叠群，无线粒体重叠群），提示喷口环境可能加速DNA降解。
**3.5 基于UCE和线粒体基因的系统发育关系**
WGS数据仅回收0–230个UCE位点，UCE捕获数据回收142–1001个UCE位点。排除位点不足的分类群后，构建了三个UCE矩阵进行分析。Matrix-A（1,246个分区）的最大似然树恢复了Venerida目科级关系的良好支持（超快自举值=100），并恢复Pliocardiinae亚科内两个主要支系：（Pliocardia + (Turneroconcha + (Abyssogena + Calyptogena))）和独特的Archivesica支系。Matrix-B（1,036个分区）支持相同拓扑并在属间提供改进支持。然而，基于转录组衍生探针的Matrix-C产生了不一致且支持较弱拓扑。尽管如此，贝壳来源的A. marissinica UCE位点在所有分析中一致形成单系支系（超快自举值97–100）。
基于包含31个物种的13个蛋白编码基因（11,441 bp）的Matrix-D线粒体系统发育树也恢复了类似的两支系拓扑。三种Archivesica物种的贝壳线粒体DNA与同种或姐妹种的新鲜软组织数据稳健地聚在一起，验证了其分类学归属。然而，一些亚支系位置与UCE拓扑不同，包括(Ectenagena elongata + (Turneroconcha magnifica + ‘Vesicomya’ kaikoae))位于(‘Calyptogena’ nautilei + Pliocardia)之外，以及Archivesica kawamurai、(Archivesica tsubasa + Archivesica extenta)和Archivesica nankaiensis支持较弱（超快自举值31–74）。
**四、讨论与结论**
UCE靶向捕获策略在双壳类贝壳古代DNA研究中显著提升了信息性核位点的回收效率。尽管古代贝壳的整体内源DNA含量低于骨骼或软组织，靶向捕获仍能将靶向读取率提高至与传统博物馆样本相当的水平，表明这一方法对高度降解的碳酸钙生物矿物具有良好适用性。贝壳DNA损伤特征与环境条件密切相关：冷泉环境的低温和稳定条件有利于DNA保存，而热液喷口的较高温度和特殊地球化学条件可能加速DNA降解。贝壳保存状态，特别是角质层的保留程度，可作为评估DNA保存潜力的重要指标。
系统发育分析为Pliocardiinae亚科内部关系提供了新的见解。UCE和线粒体数据均支持将Archivesica属识别为单系支系，但线粒体和核标记之间存在一定程度的拓扑不一致，表明需要更密集的分类群采样和更高质量的基因组数据集来稳定属级关系。联合线粒体基因组捕获和UCE富集策略有助于将古代贝壳材料整合到更广泛的软体动物系统发育基因组学分析中。
本研究表明，UCE靶向捕获是从高度风化、古老的深海鲜贝壳中回收系统发育基因组数据的有效策略。该方法通过提高低内源DNA含量样本的数据回收率，能实现系统发育重建，并有助于阐明环境和暴露时间对贝壳DNA保存的影响。作为现有基因组工具的补充，靶向捕获与贝壳古代DNA的结合将显著推动进化历史重建、历史种群连通性评估以及海洋双壳类和其他钙化生物保护策略的制定。UCE与古代DNA的结合可将亚化石和古代贝壳材料转化为分子生态学的重要资源，为从博物馆标本、考古软体动物贝壳和其他带壳生物中提取遗传信息开辟了可能性。
