《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Exploring antioxidant and plant growth-promoting potential of secondary metabolites from
Heteropogon contortus and its endophytic fungi through
in vitro and
in silico approaches
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摘要与植物相关的内生真菌是生物活性代谢产物的来源，不仅具有农业重要性，还具有生物技术潜力。在本研究中，从 Heteropogon contortus（须芒草）中分离出 81 个真菌内生菌分离物，属于 76 个真菌物种。在这些物种中，选择了 Aspergillus ochrac
摘要
与植物相关的内生真菌是生物活性代谢产物的来源，不仅具有农业重要性，还具有生物技术潜力。在本研究中，从 Heteropogon contortus（须芒草）中分离出 81 个真菌内生菌分离物，属于 76 个真菌物种。在这些物种中，选择了 Aspergillus ochraceus（赭曲霉）、Chaetomium subaffine（亚拟毛壳菌）、Penicillium commune（类曲青霉）、Penicillium islandicum（冰岛青霉）和 Pestalotiopsis guepinii（盖氏拟茎点霉）进行进一步研究。植物化学筛查显示存在黄酮类、酚类、苷类、生物碱、甾体和三萜类化合物，其中 C. subaffine 具有最广泛的谱系。在循环伏安分析中，H. contortus 的甲醇提取物和 C. subaffine 的乙酸乙酯提取物具有最高的氧化还原电位。关于对植物的生长促进效应，辣椒和玉米均观察到了 100% 的萌发率，其中 C. subaffine 提取物表现出最高的生长反应。使用 Orbitrap 高分辨 LC–MS，在宿主提取物中鉴定出 10 种主要代谢物，而在 C. subaffine 中鉴定出 5 种代谢物。分子对接结果表明，化合物 (+)-aphidicolin（（+）-蚜虫草素）对各种蛋白质表现出良好的结合亲和力，包括 2CDU（?11.380 kcal mol?1）、6KU3（?11.283 kcal mol?1）和 3OGM 蛋白复合物（?13.283 kcal mol?1），而化合物 andrographolide（穿心莲内酯）对 6KU3（?13.283 kcal mol?1）和 4LDY（?8.965 kcal mol?1）表现出高结合亲和力。在简正模（NM）版本中进行的这种模拟分析结果还显示，(+)-aphidicolin–2CDU 和 artemisinin–2CDU（青蒿素–2CDU）保持稳定。目前的结果表明，H. contortus 及其内生真菌是可持续农业中抗氧化和促生长代谢产物的潜在来源。
引言
内生真菌是定殖于植物内部组织而不引起明显病害症状的微生物，构成了与植物相关的微生物群落的重要组成部分。通过与宿主的多样化生态相互作用，内生真菌可以通过影响营养获取、生长调节以及对生物和非生物胁迫的耐受性来促进植物适应性 [1]。这些真菌的主要特征之一是它们能够产生结构多样的次生代谢产物，包括生物碱、酚类、萜类、多酮类、甾体和其他特化化合物，这在医药、农业和工业应用中引起了相当大的兴趣（Aly 等，2011；[2]）。
禾本科植物（Poaceae）代表最具多样性和生态重要性的植物群之一，并支持复杂的内生微生物群落。与禾本科相关的内生菌可以通过增强对干旱、盐碱、病原体、植食性和其他环境胁迫的耐受性来影响宿主适应性，同时也促进植物生长和生产力。然而，许多本土和生态重要的禾本科植物的内生真菌多样性仍未得到充分表征，特别是在其代谢产物产生能力和功能属性方面。最近的研究强调了与禾本科相关的内生菌作为与植物生长促进和胁迫韧性相关的代谢产物和微生物性状来源的潜力 [3]。
Heteropogon contortus (L.) P. Beauv. ex Roem. & Schult.，通常被称为 spear grass（须芒草），是一种广泛分布于自然草原和边缘环境的多年生热带和亚热带草本植物。其在相对恶劣的环境条件下持续存在的能力使其成为草原生态系统的重要组成部分。尽管具有重要的生态意义，但关于其内生真菌群落的多样性和功能潜力的信息相对有限。特别是，H. contortus 相关内生菌产生具有抗氧化和植物生长促进特性的次生代谢产物的能力仍未得到充分探索。因此，表征这一未充分利用的真菌资源可能为植物 - 真菌相互作用提供新的见解，并确定与可持续农业和天然产物研究相关的候选真菌或代谢产物。
已知内生真菌能产生广泛的次生代谢产物，包括酚类化合物、黄酮类、生物碱、萜类、苷类、甾体和多酮类 [2]。其中许多代谢物表现出抗氧化、抗菌、抗炎和其他生物活性。酚类化合物和黄酮类可以通过其电子或氢供体特性贡献抗氧化活性，并可能有助于调节与过量活性氧（ROS）积累相关的氧化应激 [4]。除了其抗氧化潜力外，内生真菌还可通过产生或调节植物激素、铁载体、有机酸和其他与生长相关的代谢物来促进植物生长 [5]。这种微生物功能可以影响种子萌发、根系发育、营养获取和植物对环境胁迫的耐受性。因此，内生真菌越来越被作为微生物生物刺激剂和其他可持续农业投入品的潜在来源进行研究。
最近代谢组学的进展通过能够在单一分析工作流程中检测和注释多种代谢物，改善了对复杂真菌和植物提取物的表征。基于 Orbitrap 的高分辨液相色谱 - 质谱联用（OHR LC–MS）为复杂生物样本中代谢物的表征提供了高质量准确性和分辨率。互补的计算方法，如分子对接，可用于预测选定代谢物与生物相关蛋白靶标之间可能的相互作用。当使用诸如 iMODS 的平台进行简正模分析（NMA）时，可以提供有关蛋白 - 配体复合物内在柔性和构象动态的信息。重要的是，这些计算方法提供预测性或支持性证据，不能单独建立生物活性；实验验证仍然是必不可少的。
尽管对与禾本科相关的内生菌的兴趣日益增加，但与 H. contortus 相关的真菌群落及其功能和代谢产物产生潜力仍未得到充分研究。因此，本研究旨在表征与 H. contortus 相关的内生真菌，并评估选定分离物的植物化学、抗氧化和植物生长促进特性。具体目标包括：(i) 分离和表征与 H. contortus 相关的内生真菌；(ii) 使用分光光度法和电化学方法评估选定真菌和宿主植物提取物的植物化学成分和抗氧化特性；(iii) 评估选定真菌提取物对辣椒和玉米种子萌发及早期植物生长的影响；(iv) 使用 Orbitrap 高分辨 LC–MS 表征选定提取物中存在的主要代谢物；以及 (v) 使用分子对接和 NMA 研究选定代谢物与生物相关蛋白靶标的预测相互作用和构象特征。通过整合真菌多样性、化学分析、生物测定和计算分析，本研究旨在为与 H. contortus 相关的内生菌提供功能评估，并确定有前景的真菌资源和代谢产物，以供在农业和生物技术应用中进行进一步研究。
章节摘要
内生真菌来源
从卡纳塔克邦巴德拉野生动物保护区的 Lakkavalli 森林地区采集了看似健康的植物样品（花序、茎秆和叶片），放入灭菌聚乙烯袋中带回实验室，在自来水下冲洗并吸干水分。草样依次在过氧化氢（3%，3 分钟）、乙醇（70%，3 分钟）和次氯酸钠（2%，3 分钟）中进行表面消毒，然后切成 1 厘米长的片段。表面消毒后的片段
结果与讨论
总共获得 81 个内生真菌分离物，代表分布在 32 个属和 17 个科的 76 个物种，以及 5 个分类地位不确定的分离物。总共对 47 个无性型子囊菌分离物进行了分组，代表 28 个属，22 个有性型子囊菌和 7 个形态型分离物。其中，最常见、占优势和区域普遍的真菌分离物，即 Aspergillus ochraceus、Chaetomium subaffine、Penicillium commune、Penicillium
结论
本研究证明 Heteropogon contortus 拥有一个具有良好生化特性的多样化内生真菌群落。在选定的分离物中，Chaetomium subaffine 表现出多样化的真菌代谢物谱系，并在实验条件下显示出抗氧化和植物生长促进活性。分光光度法和电化学分析表明宿主和真菌提取物具有抗氧化潜力，而种子萌发测定显示
CRediT 作者贡献声明
R. Nischitha: 写作 – 审查 & 编辑，写作 – 初稿，数据整理。 M.B. Shivanna: 写作 – 审查 & 编辑。
伦理批准与参与同意
不适用，因为本文不涉及任何作者与人类参与者或动物进行的任何研究。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报告的工作。
致谢
我们向印度理工学院孟买分校的 SAIF 提供 OHR LC-MS 服务表示衷心的感谢。
R. Nischitha|M.B. Shivanna
生物多样性和古生物学（真菌）小组，MACS- 阿格卡尔研究所，Gopal Ganesh Agharkar 路，浦那，马哈拉施特拉邦，411 004，印度
