将脂肪酶共价固定在醛基改性的阿拉伯胶/磁性壳聚糖纳米颗粒上，用于大豆油的水解

《Process Biochemistry》：Covalent Immobilization of Lipase on Aldehyde-Functionalized Gum Arabic/Magnetic Chitosan Nanoparticles for Soybean Oil Hydrolysis

　　

摘要

高效回收和再利用脂肪酶仍然是脂质生物催化中的主要挑战。在这项研究中，开发了醛基化的阿拉伯胶改性磁性壳聚糖纳米颗粒（GA-CHO/MCNPs）作为用于脂肪酶固定的生物聚合物基磁性载体。该载体通过原位共沉淀法制备，随后进行过碘酸氧化的阿拉伯胶表面修饰。在优化条件下，蛋白质负载量和基于蛋白质的固定产率分别达到112.5±4.8 mg/g，而回收的酶活性为62.7±3.1%。与游离脂肪酶相比，Lipase@GA-CHO/MCNPs表现出更高的最高温度（45°C对比35°C）、更好的pH值和热处理耐受性以及方便的磁回收性能。固定作用使表观K_m从2.12增加至3.85 mM，并降低了V_max和k_cat，表明存在与载体相关的扩散和空间限制。尽管如此，固定的脂肪酶仍实现了91.2%的大豆油水解产率，在10次再利用循环后保留了82.3%的初始活性，在4°C储存30天后仍保留了84.8%的活性。结果表明，通过醛-胺介导的偶联策略成功实现了脂肪酶的固定，并展示了GA-CHO/MCNPs作为可回收生物聚合物基载体的潜力，适用于大豆油水解。

引言

脂肪酶（即三酰基甘油酰水解酶，EC 3.1.1.3）是重要的界面生物催化剂，在温和的反应条件下催化脂质的水解、酯化和转酯化。由于它们具有高的底物特异性、催化多功能性和在油脂改性、香料酯合成、生物柴油生产及制药加工中的广泛应用，脂肪酶在工业生物催化领域受到了广泛关注[1]。然而，游离脂肪酶的实际应用仍受到其操作稳定性差、易受热和pH值影响失活、从多相反应系统中难以回收以及再利用性有限的限制[2]。这些缺点增加了整体工艺成本，限制了脂肪酶在脂质转化中的大规模应用。

酶的固定通常被认为是一种有效的策略，可以提高酶的稳定性、实现催化剂的回收并增强操作性能。在不同的固定载体中，磁性纳米颗粒因其高比表面积、短的扩散距离以及在外部磁场下的快速分离而被广泛研究[3][4]。这些特性对于油水反应系统特别有吸引力，因为在这些系统中，传统的回收方法（如离心和过滤）往往效率低下。然而，裸露的磁性氧化铁纳米颗粒容易聚集和氧化，并且通常缺乏足够的反应性官能团以稳定地附着酶。因此，需要用生物聚合物对其进行表面修饰，以改善其胶体稳定性、生物相容性和酶装载能力。

壳聚糖是一种天然的聚氨基多糖，常用于磁性纳米颗粒的功能化。其丰富的氨基和羟基可以提供进一步化学修饰和酶固定的反应位点[5]。然而，将酶直接固定在壳聚糖基底上通常需要使用低分子量的交联剂（如戊二醛）。虽然戊二醛对于共价固定是有效的，但过度的交联或渗透到酶结构中可能会导致构象变形和部分催化活性的丧失。因此，开发既能稳定附着酶又能提供有利催化微环境的生物相容性大分子交联剂是非常理想的。

阿拉伯胶是一种天然的、高度分支的阿拉伯半乳糖-蛋白质生物聚合物，具有良好的生物相容性和结构灵活性[6]。其邻位二醇基团可以被过碘酸钠氧化生成醛基化的阿拉伯胶（GA-CHO）[7]。由此产生的醛基可以与壳聚糖和酶分子上的氨基反应，从而通过醛-胺介导的偶联方式附着酶。在本研究中，并未直接评估阿拉伯胶的界面贡献。

选择Candida rugosa脂肪酶（CRL）作为模型酶，因为这是一种广泛研究的非特异性三酰基甘油水解酶[8]。CRL可以在甘油骨架的不同位置水解酯键，并已应用于各种植物油和三酰基甘油底物的水解，无论是游离形式还是固定形式[9][10]。其广底物耐受性和良好的水解性能使其适合用于评估用于大豆油水解的固定生物催化剂。

尽管已经分别报道了磁性壳聚糖、氧化多糖和固定脂肪酶系统，但构建用于CRL固定的醛基化阿拉伯胶/磁性壳聚糖载体方面的研究仍不够充分。特别是，大分子醛介导的固定、磁回收、界面行为和大豆油水解性能之间的关系需要进一步阐明。

在这项工作中，通过原位共沉淀法制备了GA-CHO/MCNPs，随后用过碘酸氧化的阿拉伯胶进行表面修饰。使用设计的醛基化载体进行CRL的固定，以实现醛-胺介导的偶联。通过SEM、DLS、ζ电位、FTIR、XRD、TGA、VSM和XPS对载体和固定的酶进行了表征。进一步评估了固定制剂的酶负载量、基于活性的固定效率、回收的酶活性、pH值和温度依赖性、动力学行为、热稳定性、大豆油水解效果、再利用性、储存稳定性和酶渗漏情况。本研究旨在提供一种可磁性回收的脂肪酶系统用于脂质水解，同时揭示基于多糖的共价固定所涉及的催化权衡。

章节摘录

材料

脂肪酶（来自Candida rugosa，≥ 700 U/mg）、壳聚糖（CS，脱乙酰度≥ 85%，低分子量）、阿拉伯胶（GA）和过碘酸钠（NaIO₄）购自Sigma-Aldrich。六水合三氯化铁（FeCl₃·6H₂·6H₂）、七水合硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂）和p-硝基苯基棕榈酸酯（p-NPP）购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）。精炼大豆油购自当地超市。所有其他化学试剂均为分析纯。

磁性生物聚合物载体的制备策略和形态

通过层层自组装策略制备了一种磁性仿生载体。首先，通过一步原位共沉淀法合成了磁性壳聚糖纳米颗粒（MCNPs）。在此过程中，Fe²⁺和Fe³⁺离子在壳聚糖的多阳离子网络中共同沉淀，确保了超顺磁核心与聚合物壳的紧密结合[16]。随后，MCNPs的氨基（-NH²）与GA-CHO的醛基（-CHO）通过共价交联

结论

在这项研究中，制备了醛基化的阿拉伯胶改性磁性壳聚糖纳米颗粒，作为可回收的生物聚合物基载体用于CRL的固定。结构和表面分析证实了磁性多糖载体的形成，并支持了成功的酶固定。固定后的酶显示出112.5 ± 4.8 mg/g的蛋白质负载量、84.6 ± 2.9%的基于蛋白质的固定产率以及62.7 ± 3.1%的回收酶活性。与游离状态相比

CRediT作者贡献声明

于晓红：写作 – 审稿与编辑，项目管理。丁卓莫：验证、研究、正式分析。林新悦：写作 – 初稿撰写，方法学设计，数据管理，概念构建。古丽娜·贝克图尔孙：写作 – 审稿与编辑，验证，正式分析，概念构建。金文斌：写作 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金筹集。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了盐城理工大学校级研究项目（xjr2021028）的支持。

作者声明没有已知的会影响到本文所述工作的财务利益或个人关系。

金文斌|古丽娜·贝克图尔孙|林新悦|丁卓莫|于晓红

盐城理工大学海洋与生物工程学院，希望大道1号，盐城224051，中国