3-(R2=甲基，苯基)-1H-[1]苯并吡喃[4,3-c]吡唑-4-酮衍生物的合成、体外抗氧化评价及计算机模拟COX抑制活性

《Results in Chemistry》：Synthesis, in vitro antioxidant evaluation, and in silico COX inhibitory activity of 3-(R2?=?methyl, phenyl)-1H-[1]benzopyran[4,3- c]pyrazol-4-one derivatives

　　

吡唑官能团广泛存在于多种生物活性化合物中，其与香豆素部分融合可形成一类称为香豆素-吡唑（coumarin-pyrazoles）的分子。文献报道香豆素-吡唑具有抗增殖、抗氧化和抗炎活性。研究人员设想了一系列香豆素-吡唑作为具有潜在抗氧化和抗炎活性的分子。通过分析选择性环氧合酶-2（COX-2）抑制剂与COX-2的分子形状和相互作用，并计算其极性表面积、静电势图、理化性质和ADME谱，对这些分子进行了设计。通过分子对接计算在COX-2和COX-1上评估了所合成香豆素-吡唑作为COX抑制剂的潜力。对接结果表明，化合物6a和5b与COX-2的结合能比与COX-1更为有利，此外5b、5c和6(a-d)与COX-2结合位点的关键残基形成了氢键。受此结果推动，研究人员以30%至58%的产率合成了新型香豆素-吡唑。合成方法涉及两种主要途径：一种是在乙酸铜作为路易斯酸辅助下，对肼基香豆素中间体进行酸催化环化；另一种是一步缩合法，不分离腙中间体，化合物6b在酸性条件下直接环化。使用DPPH试验评估了所合成香豆素-吡唑的抗自由基活性。结果发现，化合物5(a-d)和6a表现出高于50%的DPPH自由基清除活性。为了合理化其抗氧化活性，还计算了HOMO和LUMO、电离势图、电负性、硬度（hardness）和软度（softness）描述符。

该论文发表在《Results in Chemistry》，报道了一类新型香豆素-吡唑衍生物的设计、合成、体外抗氧化活性评价及计算机模拟COX抑制活性研究。吡唑（pyrazole）是多种生物活性分子的核心骨架，与香豆素（coumarin）融合形成的香豆素-吡唑杂合体兼具二者的化学性质与药理潜力。文献已报道此类化合物具有抗增殖、抗氧化和抗炎活性，尤其是作为选择性环氧合酶-2（COX-2）抑制剂在抗炎药物开发中备受关注。然而，尽管香豆素-吡唑结构具有治疗潜力，其结构变异（如取代基类型和位置）与COX-2选择性之间的关系仍不清楚，且该类化合物的抗氧化活性此前缺乏系统研究。因此，本研究旨在设计并合成系列新型香豆素-吡唑衍生物，通过体外抗氧化试验和计算机模拟分子对接评估其作为COX-2抑制剂及抗氧化剂的双重潜力，并利用量子化学描述符解释活性差异。

研究人员以已知活性化合物3b-G及无活性类似物3i-G为结构参考，结合Coxibs类选择性COX-2抑制剂与COX-2复合物（PDB:3LN1和1CX2）的结合模式分析，采用Craig图选取不同亲脂性和电子效应的取代基（-OH、-N(CH₂CH₃)₂、-OCH₃）引入香豆素-吡唑骨架的R1位，并在C3位分别引入甲基或苯基，设计出目标化合物5(a-d)（C3-甲基系列）和6(a-d)（C3-苯基系列）。所有化合物首先通过PM6半经验方法和M06-2×/6-311+G(2d,p)密度泛函计算进行几何优化，随后计算分子静电势（MEP）图、HOMO/LUMO前线轨道、电离势图、电负性、硬度、软度等量子描述符。分子对接采用AutoDock Vina软件，在COX-2（PDB:3LN1）和COX-1（PDB:3KK6）晶体结构中进行，并以塞来昔布（celecoxib）和3b-G的已知结合模式验证了方法的可靠性，RMSD值分别为0.19 ?和0.48 ?。合成方面，大部分化合物通过两步法完成：先由香豆素与苯肼缩合制得肼基香豆素中间体，再在乙酸铜（Lewis酸）催化下经酸介导环化得到目标产物；其中化合物6b因中间体不稳定，采用一步缩合法在甲苯中以CaCl₂干燥剂和乙酸催化直接环化。目标产物产率30%–58%，结构经¹H NMR、¹³C NMR、IR、HRMS及单晶X射线衍射（化合物5b）确证。体外抗氧化活性采用DPPH自由基清除试验，以抗坏血酸为阳性对照，4-甲基伞形酮为结构参考。

结果部分保留原文小标题：
（1）分子设计（Molecular design of coumarin-pyrazole derivatives）：MEP图显示，与参考Coxibs相比，所设计化合物的V形几何因香豆素-吡唑环和R1取代基而扭曲。电子互补性分析表明，5c、6a、6c和6d与活性参考3b-G及Coxibs具有更好的形状和电子密度相似性，预示潜在COX-2抑制活性；而5b和6b类似于无活性的5d，MEP负区覆盖香豆素-吡唑环，活性可能较低。理化计算显示，所有新化合物的水溶性较Coxibs提高，LogP值降低、极性表面积（PSA）增大。ADME预测结果与Coxibs相似，胃肠道吸收和生物利用度良好，且无Veber或Egan规则违例。
（2）分子对接（Molecular docking calculations）：对接验证成功重现了塞来昔布在COX-2和COX-1中的结合模式。参考化合物3b-G与COX-2结合能为-11.3 kcal/mol，强于其与COX-1的结合（-10.2 kcal/mol），且与塞来昔布结合方式相似。对于5系列，5d因缺乏与Tyr355的氢键并与Ser530发生空间冲突，与其已知无选择性COX-2抑制活性一致；其余5(a-c)均与Tyr355形成氢键。对于6系列，6a与COX-2的结合能最高（-12.8 kcal/mol），优于塞来昔布（-11.3 kcal/mol），其苯基与Trp387形成π-π作用，香豆素环与Ala527、Leu531、Val349等疏水残基接触。6d与His90形成π-π作用，该残基仅与紧密结合、非时间依赖性COX-2抑制剂相关，提示其可能具有选择性。整体上，6(a-d)比5(a-d)触及更多关键残基（如Val523、His90、Arg513），这归因于C3位苯基提供了额外疏水体积。对接结果还显示，6b和6d结合能较低，但6b与Met522形成π-硫作用，6d则与His90和Arg513接触，表明结合能并非唯一决定因素。
（3）合成（Synthesis）：通过两条路线成功合成全部8个目标化合物，产率30%–58%。NMR化学位移确认了吡唑环的形成，C3信号符合吡唑典型值，C7化学位移受R1供电子能力影响，顺序为OCH₃ > N(CH₂CH₃)₂ > OH > H。
（4）化合物5b的结构研究（Structural study on compound 5b）：单晶X射线衍射显示5b属三斜晶系P-1空间群，吡唑环内键长符合sp²杂化特征，三个稠环共面，苯基与平面二面角为72.93°，与NMR中H5的低场位移一致。分子间通过C-H…O氢键形成二聚体，并进一步经C-H…π作用延伸成一维链。
（5）DPPH自由基清除活性（DPPH radical scavenging activity）：所有化合物在1 mg/mL浓度下均表现清除活性（约41%–70%）。其中6a活性最高（≈69.6%），5系列稳定在60%–65%，6b、6c、6d活性较低。HOMO分布显示6a的HOMO延伸至C3苯基，有利于电子或氢原子供给；而6(b-d)的HOMO集中于香豆素-吡唑核。量子描述符分析表明，R1位供电子取代基降低C9氢酸性，削弱氢原子转移能力，从而降低抗氧化活性。5系列由于苯基在N1位共振，维持了稳定的抗氧化能力。所有化合物活性均高于4-甲基伞形酮，但低于抗坏血酸。

讨论部分指出，C3位苯基（6系列）显著增强与COX-2关键残基的相互作用，尤其是Val523和His90，为选择性抑制提供了结构基础；而R1位引入供电子基（如二乙氨基、甲氧基）会降低抗氧化活性，但并未明显破坏COX-2结合。结构-活性关系总结为：无取代的R1（即氢）与C3苯基组合是获得双重抗氧化活性和预测COX-2亲和力的最佳特征。量子化学描述符为上述SAR提供了电子结构层面的解释。研究结论强调，化合物6a表现出最平衡的活性谱，兼具最强的COX-2结合能（-12.8 kcal/mol）和最高的DPPH清除率（≈70%），是进一步优化的先导化合物。然而，分子对接预测仍需实验验证，包括酶抑制试验和体内抗炎评价。本研究为开发兼具抗炎和抗氧化作用的新型香豆素-吡唑衍生物奠定了实验和理论基础。