AlphaFold3 对 mt-TR s... 的预测建模

《Cancer Research Communications》：AlphaFold3 predictive modeling of mt-TR s...

　　

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**摘要**

线粒体 DNA (mtDNA) 多态性如何影响复杂表型仍知之甚少。利用线粒体 - 核交换小鼠，我们此前表明 mtDNA 单核苷酸多态性 (SNP) 独立于代谢差异可修饰转移、心血管疾病和表观遗传标记。与这些表型相关的唯一 mtDNA SNP 位于编码线粒体转运 RNA (tRNA)- 精氨酸 [mt-tRNAArg (UCG), mt-TR] 的基因中，表明非蛋白质编码位点的作用。在本研究中，我们鉴定并初步表征了之前未描述的由 mt-TRs 产生的 tRNA 来源片段 (tRF)。Northern 印迹显示存在不同的 tRF，它们在 mtDNA SNP、肺和肝之间以及性别之间差异表达。令人惊讶的是，未经处理的 RNA 的小 RNA 测序并未高丰度检测到相同的 tRFs。然而，去甲基化并恢复 5′-OH 和 3′-PO4 末端使得能够检测到与 Northern 印迹条带一致的序列。强制与线粒体基因组精确匹配并归一化至其亲本分子，揭示了具有共有切割位点的推定 tRF 序列。基于 mtDNA SNP、由此产生的 SNP 依赖性 tRF 以及 SNP-转移相关性之间的联系，我们提出这些 tRF 可能作为转移修饰因子发挥作用。这些数据还扩展了线粒体基因组的功能输出，有助于表型修饰。**意义：**本研究描述了疑似调节转移效率的线粒体 tRNA 片段的鉴定和初步表征。

**引言**

Hunter 及其同事 (1) 通过让 FVB/N 背景的雄性 MMTV-PyMT 小鼠与来自不同近交系背景的雌性小鼠杂交，证明了遗传背景影响转移效率。我们假设母系来源的线粒体 DNA (mtDNA) 遗传修饰因子可能在至少部分程度上负责他们的观察结果 (2–4)。为了将线粒体基因型作为独立的实验变量分离出来，生成了线粒体 - 核交换 (MNX) 小鼠 (5, 6)，从而能够系统评估 mtDNA 对肿瘤表型的贡献。线粒体多态性以依赖于致癌驱动因子的方式，对肿瘤和转移形成施加了内在和外在的改变 (3, 4)。来自实验和临床样本的积累数据增加了 mtDNA 影响多种复杂表型的证据 (2, 6–11)；然而，负责其作用的机制仍然未知。由于线粒体在代谢中的核心作用，且因为线粒体基因组仅编码 13 种蛋白质，全部位于电子传递机械中，进行了 >700 种代谢物的代谢组学分析。未观察到可归因于 mtDNA 变异而在 MNX 小鼠肺或乳腺组织中出现的全球性代谢转变。正如预期，代谢物主要按核基因型聚类 (补充图 S1)。关于广泛代谢重编程的这些阴性结果提示，mtDNA 可能通过超越经典生物能学的机制影响转移 (3, 4)。结合核 DNA 甲基化位点有限的、离散的变化 (8)，我们假设线粒体基因组的非蛋白质编码转录本可能作为转移修饰因子发挥作用。对 MNX 和野生型线粒体基因组中单核苷酸多态性 (SNP) 的比较分析，突出了线粒体精氨酸转运 RNA (tRNA) [mt-tRNAArg (UCG), 后文缩写为 mt-TR; 图 1A–C] 内部一个具有品系依赖性插入和缺失的多态性位点。我们假设 mt-TR 中的 SNP 调节 tRNA 切割产物——称为 tRNA 来源片段 (tRF; 参考文献 12–14) 的小非编码 RNA 的生成，这可能影响转移所需的生物过程。同样，含有不同 SNP 的 tRF 可能差异性地影响表型。

**图 1.** 打开大图下载幻灯片 MNX 和野生型小鼠的线粒体基因组中的 SNP 对应于肝脏组织中的 tRF 模式。A，相对于 C57BL/6J 小鼠线粒体基因组 (NC005089.1)，C3H/HeJ (CM004255.1) 和 FVB/NJ (CM004184.1) 的基因组中存在编码位置 7778、8889、9348、9461 和 11780 以及编码 tRNAArg (mt-TR) 的基因内的 SNP。B，跨品系，核苷酸位置 9820 处或附近的 SNP 位于 mt-TR D-环内 (红色)。C，C (C57BL/6J)、H (C3H/H3J) 和 F (FVB/NJ) 品系中 mt-TR 的完整序列，从 5′ 到 3′ 书写，包括转录后添加的 3′ 末端胞嘧啶 - 胞嘧啶 - 腺嘌呤 (CCA) 帽。Northern 印迹杂交探针靶向的区域如下所示：分子中间的下划线区域由探针 R3 结合，粗体区域由探针 R4 结合，远端 3′ 端的下划线区域由探针 R5 结合。D–I，mt-TR 长度为 71–73 nt，取决于 mtDNA 品系 (注意 D 中的连接线)，以及通过使用探针 R3 (D 和 G)、R4 (E 和 H) 或 R5 (F 和 I) 在男性 (D–F) 或女性 (G–I) 肝脏组织中通过 Northern 印迹检测到的 tRF。

**图 1.** 打开大图下载幻灯片 MNX 和野生型小鼠的线粒体基因组中的 SNP 对应于肝脏组织中的 tRF 模式。A，相对于 C57BL/6J 小鼠线粒体基因组 (NC005089.1)，C3H/HeJ (CM004255.1) 和 FVB/NJ (CM004184.1) 的基因组中存在编码位置 7778、8889、9348、9461 和 11780 以及编码 tRNAArg (mt-TR) 的基因内的 SNP。B，跨品系，核苷酸位置 9820 处或附近的 SNP 位于 mt-TR D-环内 (红色)。C，C (C57BL/6J)、H (C3H/H3J) 和 F (FVB/NJ) 品系中 mt-TR 的完整序列，从 5′ 到 3′ 书写，包括转录后添加的 3′ 末端胞嘧啶 - 胞嘧啶 - 腺嘌呤 (CCA) 帽。Northern 印迹杂交探针靶向的区域如下所示：分子中间的下划线区域由探针 R3 结合，粗体区域由探针 R4 结合，远端 3′ 端的下划线区域由探针 R5 结合。D–I，mt-TR 长度为 71–73 nt，取决于 mtDNA 品系 (注意 D 中的连接线)，以及通过使用探针 R3 (D 和 G)、R4 (E 和 H) 或 R5 (F 和 I) 在男性 (D–F) 或女性 (G–I) 肝脏组织中通过 Northern 印迹检测到的 tRF。关闭模态

tRFs 已成为一类由成熟或前体 tRNA 精确切割产生的调控性小 RNA (12–14)。tRFs 主要从核编码 tRNA 中表征，已发现其与翻译抑制 (15)、RNA 沉默 (16)、凋亡调节 (17) 以及癌症进展和转移 (18–20) 有关。尽管对核 tRF 生物学的认识日益增加，但线粒体基因组代表了小调控 RNA 的一个尚未充分探索的来源。与核 tRNA 基因不同，线粒体 tRNA 作为多顺反子转录本的一部分进行转录，缺乏内含子，并根据 tRNA 标点模型进行处理，这提出了不同的生物发生途径可能产生独特的线粒体 tRF 的可能性 (21–25)。在这里，我们报道了之前未描述的源自含有 SNP 的线粒体 tRNA 的 tRF 的发现及其早期表征。基于 mtDNA SNP、由此产生的 SNP 依赖性 tRF 以及 SNP-转移相关性之间的联系，我们提出这些候选 tRF 可能作为转移修饰因子发挥作用。这些发现扩展了线粒体基因产物的范围，并提出了一种新的框架，通过该框架 mtDNA 变异可能在小鼠模型和人类疾病中影响癌症进展。

**材料与方法**

**动物**

MNX 小鼠品系如前所述生成，通过定义近交系受精卵母细胞之间的原核转移，以创建具有不匹配的核和线粒体基因组的小鼠 (5, 26)。MNX 群体在内部繁殖，包括来自 C57BL/6J (RRID:IMSR_JAX:000664)、C3H/HeN (RRID:MGI:2160972)、FVB/NJ (RRID:IMSR_JAX:001800) 和 BALB/cJ (RRID:MGI:2161072) 背景的谱系组合，野生型对照来自商业供应商 (杰克逊实验室或 Inotiv，前身为 Envigo)，并在运输后适应 7 天或更长时间。我们使用两位字母代码表示 MNX 品系，其中第一个字母表示核基因组来源品系，第二个字母表示 mtDNA 品系 (C = C57BL/6J; H = C3H/HeN; F = FVB/NJ)。基因分型使用 Extract-N-Amp 组织 PCR 试剂盒 (MilliporeSigma, XNAT2) 和 GoTaq Green Master Mix (Promega, M712B) 进行。扩增子的线粒体背景通过菌株特异性线粒体 SNP 的限制性片段长度多态性分析进行验证，包括位置 9461 和 9348 的位点，使用 BclI (New England Biolabs, R0160S) 或 PflFI (New England Biolabs, R0595S) 消化，如前所述 (3–6)。从健康的成年动物（5 至 15 周龄）采集肺和肝脏组织，使用标准饲养管理实践进行维护，并通过双侧胸廓切开术确认的颈椎脱臼进行安乐死。所有动物程序均经堪萨斯大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准。

**小 RNA 提取**

组织保存在 RNAlater (Invitrogen, AM7024) 中并在 RNA 提取前冷冻。小 RNA 使用 mirVana miRNA 分离试剂盒 (Thermo Fisher Scientific, AM1560) 按照制造商的说明进行分离，有一个例外：与其被丢弃，小 RNA 分离的相应大 RNA 部分被保留、洗涤并洗脱，以便通过琼脂糖凝胶电泳后观察 28S 和 18S rRNA 条带来评估 RNA 完整性。完整的 RNA 样品通过乙酸钠 - 丙醇沉淀合并，在 70% 乙醇中洗涤，随后在无核酸酶水中重悬。RNA 浓度使用 Qubit microRNA 测定试剂盒 (Thermo Fisher Scientific, Q32881) 进行定量。

**Northern 印迹**

Northern 印迹使用变性尿素-PAGE 进行。合并的小 RNA (每泳道 5 μg) 在上样前在 70°C 下变性 5 分钟，在 15% 8 mol/L 尿素-PAGE 凝胶上分离，并电泳转移至尼龙膜上。膜进行 UV 交联，并在过夜 37°C 杂交前在 ULTRAhyb 缓冲液 (Invitrogen, AM8663) 中预杂交，杂交探针为 3′ 端地高辛 (DIG) 标记的锁核酸 (ssDNA) 探针，每个均由 Integrated DNA Technologies 定制合成。测试并命名为 mt-TR 互补区域 (从 5′ 到 3′) 的以下探针序列：R1a: TTTTTAAACTAATTACCA, R1b (特异性针对 C3H 来源 mtDNA 产物): TTTTAAAACTAATTACCA, R2: AATCATTAATTTTTTTT, R3: AGTCGAAATCATTAATTTT, R4: CATAATCTAATGAGTCGAAA, 和 R5: TGGTTGGTAATTATGAACA。经过高严格性和低严格性的柠檬酸钠 /SDS 洗涤后，膜进行封闭 (Roche, 11585762001) 并与碱性磷酸酶 - 偶联抗 DIG 抗体 (Roche, 0335375910) 孵育。施加 CDP-Star 底物 (Sigma, C0712) 后，通过数字成像 (Azure 600; RRID:SCR_023780) 检测化学发光信号。成像时间 (5 分钟手动) 用于所有呈现的印迹成像，以便于比较。使用与蓝色标记物偶联的 DIG 标记 RNA ladder 来近似 tRNA 和 tRF 大小 (DiagnoCine, FNK-DM270)。合并 RNA 样品的质量在单独的印迹中评估，使用 5S rRNA (AAGCCTACAGCACCCGGTATT) 的探针。全长 mt-TR 被视为看家转录本，作为便捷的加样对照。所有实验均进行重复或三次重复；显示代表性印迹。

**小 RNA 样品预处理和 RNA 测序**

使用 mirVana miRNA 分离试剂盒从小鼠肺中分离的 RNA 最初提交给 RealSeq，使用基于单接头环化的文库制备方法进行探索性 tRNA 片段测序 (27)。对于后续实验，从小鼠肝脏中提取 RNA，合并，并使用 rtStar tRF&tiRNA 预处理试剂盒 (Arraystar, AS-FS-005) 进行预处理，以去除被认为会干扰 tRF 检测的 RNA 修饰，包括 3′-氨基酰基、2′,3′-环磷酸和 5′ 羟基末端，以及 1-甲基腺苷 (m1A)、1-甲基鸟苷和 3-甲基胞苷甲基化。预处理后，使用 Agilent TapeStation 2400 及 RNA ScreenTape 和高灵敏度 RNA ScreenTape 测定评估 RNA 质量和浓度。小 RNA 文库使用 QIAseq miRNA UDI 文库试剂盒制备，并使用 QIAseq UDI miRNA 索引试剂盒 (QIAGEN) 进行索引。文库经标准化、合并，并由堪萨斯大学医学中心基因组学核心设施在 NovaSeq 仪器上测序。

**RNA 测序预处理和比对**

读长质量使用 FastQC (v0.12.1, RRID:SCR_014583) 评估。唯一分子修饰符 (UMI)-tools (v1.1.6, RRID:SCR_017048) 用于 UMI 和读长提取；然后使用 Cutadapt (v5.0, RRID:SCR_011841) 保留最小读长 16 个碱基对且最大 100 个碱基对的读长。Bowtie (v1.3.1, RRID:SCR_005476) 用于比对，参数设置为无间隙和无错配。使用 UMI-tools 对读长去重，并比对至成熟线粒体 mt-TR 的基因组序列。由于不同小鼠品系的 mt-TR 序列中存在已知 SNP，每个样品均比对至其各自的参考序列 (图 1C)。所得的一组比对读长使用 Bowtie 比对器比对至以 UCSC mm10 组装为参考的完整小鼠基因组。如果序列比对至其他位置，则标记为假阳性并从下游分析中移除。提取每个样品中每个唯一序列的读长数。

**分析**

推定 tRF 序列的读长计数通过将唯一序列的读长数除以比对至 mt-TR 的总读长数并乘以 1,000,000 进行归一化 (公式 A)。

mt-TR 归一化读长 = tRF 总读长计数 / 比对至 mt-TR 的总读长数 × 10^6 (A)

从最丰富的 10 个 mt-TR 比对读长列表中 (按样品列于补充表 S1 中)，候选 tRF 序列根据线粒体来源品系的平均归一化读长并符合金标准 Northern 印迹中可视化的条带进行暂定提名 (表 1)。

小鼠小非编码 RNA 组织图谱 (GSE119661) 被用于比较公开数据中对齐到 mt-TR 的序列 (28)。表 1. 通过 RNA 测序确定的对齐到 mt-TR 的候选 tRF 序列。

品系 | 片段序列 | 平均 mt-TR 标准化读数
CC and HC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 172,576.40
CC and HC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGA | 120,712.30
CC and HC | TTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 57,703.44
CC and HC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATT | 23,131.11
CC and HC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGA | 10,323.80
CC and HC | TTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 9,487.48
CC and HC | AAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 8,737.05
CC and HC | TTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 8,506.63
CC and HC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 8,185.45
CC and HC | TTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 6,754.55
HH and CH | TGGTAATTAGTTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 31,224.23
HH and CH | TGGTAATTAGTTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGA | 22,326.65
HH and CH | TTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 13,141.58
HH and CH | TTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 13,050.23
HH and CH | TTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 10,700.44
HH and CH | TTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 10,510.03
HH and CH | AAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 10,249.75
HH and CH | TAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 9,618.80
HH and CH | TTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 8,134.17
HH and CH | TTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 7,980.47
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 241,040.50
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGA | 96,766.04
FF and CF | TTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 41,784.64
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATT | 16,122.85
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGA | 14,831.61
FF and CF | TTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 9,913.05
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATG | 9,153.11
FF and CF | TTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 9,045.27
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTA | 8,519.76
FF and CF | TTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 8,355.08

品系 | 片段序列 | 平均 mt-TR 标准化读数
CC and HC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 172,576.40
CC and HC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGA | 120,712.30
CC and HC | TTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 57,703.44
CC and HC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATT | 23,131.11
CC and HC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGA | 10,323.80
CC and HC | TTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 9,487.48
CC and HC | AAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 8,737.05
CC and HC | TTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 8,506.63
CC and HC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 8,185.45
CC and HC | TTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 6,754.55
HH and CH | TGGTAATTAGTTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 31,224.23
HH and CH | TGGTAATTAGTTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGA | 22,326.65
HH and CH | TTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 13,141.58
HH and CH | TTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 13,050.23
HH and CH | TTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 10,700.44
HH and CH | TTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 10,510.03
HH and CH | AAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 10,249.75
HH and CH | TAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 9,618.80
HH and CH | TTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 8,134.17
HH and CH | TTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 7,980.47
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 241,040.50
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGA | 96,766.04
FF and CF | TTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 41,784.64
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATT | 16,122.85
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGA | 14,831.61
FF and CF | TTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 9,913.05
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGATG | 9,153.11
FF and CF | TTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 9,045.27
FF and CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTA | 8,519.76
FF and CF | TTTCGACTCATTAGATTATGATGATGTTCATAATTACCAACCA | 8,355.08

注：来自雌性小鼠肝脏预处理小 RNA 样本的 tRF 序列，按归一化到 mt-TR 读数的读数降序排列。mt-TR 标准化读数是相同 mtDNA 基因组品系间复制品的平均值，并经过过滤，以包含基于大小（图 1G–I）的北方杂交结果证实的推定 tRF 序列。查看大图

**tRNA 结构建模**

每种品系 (C: C57BL/6J, H: C3H/HeJ, F: FVB/NJ) 的 mt-TR 序列被输入到 AlphaFold3 (29, 30) 中，以预测由于品系间 SNPs 导致的潜在结构变化。由于对未修饰结构预测的低置信度，建模中包含了已知的人类 mt-TR 修饰，包括第 9 和 16 位的 m1A，第 10 位的 2-N-甲基鸟苷 (m2G)，以及第 29 和 36 位的假尿苷 (Ψ) (31)，以提高折叠预测的置信度。

**结果**

**mt-TR 基因中的 SNPs 与 tRF 生成相关**

尽管线粒体基因组很小，但多态性影响多种生物过程，包括转移进展 (3, 4, 11)，这可能由 tRFs 介导 (3, 4, 8–11, 19)。因为 tRFs 代表一类独特且日益被认可的调控小 RNA，我们检查了 mt-TR 是否可能类似地产生以前未表征的 RNA 物种。使用北方杂交并最初专注于转移常发生的组织，我们在雄性小鼠肝脏中鉴定出源自 mt-TR 的离散 RNA 条带模式 (图 1D–F)。这些片段在基础条件下被检测到，未在细胞应激条件下进行评估。使用旨在捕获最可能预期的 tRF 物种，即内部 tRF 或"i-tRF" (25) 的杂交探针，当针对 mt-TR 的中部区域时，我们观察到 tRF 条带的最大多样性，这与 CC 和 HC 品系的第 18 至 36 位互补，FF 和 CF 品系的第 19 至 37 位互补，以及 HH 和 CH 品系的第 20 至 38 位互补 (探针 R3，图 1C)。重要的是，条带模式在共享相同线粒体基因组的品系间更为相似（在图 1D 中最佳可视化），表明 mtDNA 背景影响片段的丰度和/或加工。当杂交探针靶向区域向 3'端移动 11 nt 时，几种片段仍然可检测 (探针 R4，图 1E)。也一致观察到小于～50 nt 的物种。相反，针对 mt-TR 3'端的杂交未产生可检测的片段 (探针 R5，图 1F)。在雌性肝脏 (图 1G–I) 以及雄性 (图 2A–C) 和雌性肺 (图 2D–F) 中检测到相似的 tRF 物种。跨组织和性别，针对 mt-TR 的 3'末端意外地未能检测到对应的小 RNA (24)。然而，我们的发现加强了源自转录本 5'和内部区域的稳定片段 ("5'-tRF"根据既定命名法; ref. 25) 产生的可能性。条带强度表明片段丰度可能因线粒体基因型、组织和性别而异 (在图 2G 和 H 中直接比较)。

图 2. 查看大图 下载幻灯片 tRF 模式在不同探针区域间一致，但因组织和性别而异。A–F, mt-TR (长度 71–73 nt) 和 tRF 通过北方杂交使用探针 R3 (A 和 D), R4 (B 和 E), 或 R5 (C 和 F) 在雄性 (A–C) 或雌性 (D–F) 肺组织中检测。G, 雌性肝脏与肺组织 tRF 模式的并排比较。H, 雄性与雌性小鼠肝脏组织 tRF 模式的并排比较。

图 2. 查看大图 下载幻灯片 tRF 模式在不同探针区域间一致，但因组织和性别而异。A–F, mt-TR (长度 71–73 nt) 和 tRF 通过北方杂交使用探针 R3 (A 和 D), R4 (B 和 E), 或 R5 (C 和 F) 在雄性 (A–C) 或雌性 (D–F) 肺组织中检测。G, 雌性肝脏与肺组织 tRF 模式的并排比较。H, 雄性与雌性小鼠肝脏组织 tRF 模式的并排比较。关闭模态框

综上所述，在约 50 nt 大小处观察到的主要 tRF 物种与从 3'末端去除约 20 nt 一致。由 mt-TR 的 5'和中部方面组成的这种 50 nt 片段大于通常由 RNA 测序平台检测到的经典 5' 半 tRF 物种。缺乏代表 19 至 21 nt 片段的可检测条带，对应于任何潜在的 3'切割产物，表明快速降解或丰度低于我们北方杂交方案中的检测限。尽管如此，此类产物可以通过 miRNA 特异性文库制备进行扩增和测序 (补充表 S1)。基于这些发现，我们提出了一个模型，其中 mtDNA SNPs 改变 mt-TR 结构，潜在地影响核酸酶可及性和 tRF 生物发生期间的切割模式，这与北方杂交观察到的片段模式和丰度的品系特异性差异一致，并与 mtDNA 依赖性转移负担相关。

**tRF 源自 mt-TR，经过转录后修饰并在特定位点切割**

试图定义从 mt-TR 切割的 tRF 序列，我们首先使用单接头和基于环化的文库制备方法进行小 RNA 测序，这些方法以前已验证用于 miRNA 分析 (27)。这一初步努力未能检测到对应于通过北方杂交可视化的条带的适当大小的对齐到 mt-TR 的片段 (数据可在 GSE324706 获取)。tRNA 被广泛修饰，携带甲基化碱基和其他化学改变 (31)。内切核糖核酸酶 (例如，血管生成素，RNase T2 或 RNase A 超家族的成员) 的切割可能产生带有非常规 5' 和/或 3'末端的片段 (22, 32, 33)。因此，我们结合了对末端的酶促校正以恢复 5'-磷酸和 3'-羟基基团，以及使用 ArrayStar 试剂盒对选定核苷糖进行去甲基化。我们注意到，包含额外未校正修饰的片段可能仍然逃避检测。tRNA 和 tRF 测序的定量解释本质上受到多个相互影响的技术偏差的制约，这些偏差影响检测和表观丰度。tRNA 内的转录后修饰，如人类 mt-TR (31) 中存在的 m1A 和 m2G 残基，可能通过过早终止、错误掺入或可变通读阻碍逆转录，从而扭曲 tRF (34) 的恢复和序列保真度。尽管去甲基化策略可以部分缓解这些障碍，但反应效率未知，并可能通过α-酮戊二酸和二价铁离子介导的芬顿化学引入随机的 RNA 骨架切割，这很可能独立于其生物来源而富集较短片段 (35)。此外，tRF 末端化学的异质性、持续的二级结构以及接头连接、大小选择和 PCR 扩增中的偏差共同以序列和结构依赖的方式歪曲文库组成。短读长也 complicates 唯一对齐，特别是在高度同源的 tRNA 基因和线粒体 - 核序列旁系同源物中，引入了读长分配的模糊性 (36)。为了提高预测的置信度并更好地反映已知的 tRNA 折叠原则 (37)，每种品系的序列根据已报道的人类 mt-TR (m1A, m2G; Ψ: 假尿苷) 的转录后修饰 (PTM) 进行建模。综合这些因素表明，通过 RNA 测序观察到的 tRF 丰度应被解释为生物信号和选择性技术可观测性的函数，而不是细胞内 RNA 水平的严格定量测量。相对于通过北方杂交等金标准方法的直接观察，RNA 测序，无论是否经过酶促预处理，不太可能以未指明的程度低估 tRNA 和 tRF 的数量。在末端校正和去甲基化之后，这只是 tRNA 和 tRF RNA 测序复杂性的部分解决方案，几个唯一对齐到 mt-TR 的候选片段被提名 (补充表 S1)。尽管这些片段序列偶尔可在小鼠肺或肝脏的公开数据中找到，但在预处理数据中典型丰度 (每百万读数) 仅略有改善。当归一化到 mt-TR 的读数时，最丰富的物种在尽管存在底层 mtDNA SNPs 的情况下共享相同的切割位点，但总长度取决于 SNP (表 1)，支持了这些 RNA 是主动且可重复产生的而不是降解产物的结论，因为如果是后者，RNA 印迹将显示拖尾。专注于主要片段提议的切割位点，AlphaFold3 (29, 30) 对所有三种品系的 mt-TR 的预测建模显示围绕该位点的相对预测稳定性/置信度最低，位于 D-T 环相互作用区域 (图 3A 和 B)。mt-TR 的预测结构展示了 T 环中腺嘌呤 (52–54) 和尿嘧啶 (53–55) 的潜在差异暴露和稳定性 (补充图 S2; 补充表 S2)。我们推测，品系特异性 mt-TR 提议的差异性 D-T 环相互作用可能有助于该位点的稳定性或切割敏感性，有待在未来研究中调查。

图 3. 查看大图 下载幻灯片 AlphaFold3 对 mt-TR 的预测建模表明不同品系间的稳定性和 D-T 环结构存在差异。A, 每种 mt-TR (从左到右：C, H 和 F) 未经转录后修饰 (PTM) 建模，显示预测的不稳定性/低置信度。预测模板建模"pTM"分数范围为 0 到 1 量表上的 0.26 到 0.28。B, 显示三行图像，从上到下放大倍数增加。为了改进置信度预测并更好地反映已知的 tRNA 折叠原则 (37)，每种品系的序列根据已报道的人类 mt-TR PTM (m1A, m2G 和Ψ; ref. 31) 进行建模。与未修饰序列相比，PTM 的包含增加了预测稳定性和置信度评分 (pTM 范围，0.75–0.77 对比 0.26–0.28)。D-T 环相互作用的评分置信度最低，这与表 1 中片段之间常见观察到的转录本末端（C: U53/G54; H: U55/G56; F: U54/G55，在图像底部两行中以绿色高亮显示）相一致。不同品系间 D-T 环相互作用的核苷酸和结构存在差异：预测 C mt-TR 的 T 环 G54 与 D 环相互作用；预测 H mt-TR 的 T 环 U57 与 D 环相互作用；预测 C mt-TR 的 U54/G55 都与 T 环的 A17 特异性相互作用。tRF 模式在肝脏组织中列出了特定的预测键合和核苷酸中心之间的距离。pIDDT，预测局部距离差异测试。

图 3. 查看大图 下载幻灯片 AlphaFold3 对 mt-TR 的预测建模表明不同品系间的稳定性和 D-T 环结构存在差异。A, 每种 mt-TR (从左到右：C, H 和 F) 未经转录后修饰 (PTM) 建模，显示预测的不稳定性/低置信度。预测模板建模"pTM"分数范围为 0 到 1 量表上的 0.26 到 0.28。B, 显示三行图像，从上到下放大倍数增加。为了改进置信度预测并更好地反映已知的 tRNA 折叠原则 (37)，每种品系的序列根据已报道的人类 mt-TR PTM (m1A, m2G 和Ψ; ref. 31) 进行建模。与未修饰序列相比，PTM 的包含增加了预测稳定性和置信度评分 (pTM 范围，0.75–0.77 对比 0.26–0.28)。D-T 环相互作用的评分置信度最低，这与表 1 中片段之间常见观察到的转录本末端（C: U53/G54; H: U55/G56; F: U54/G55，在图像底部两行中以绿色高亮显示）相一致。不同品系间 D-T 环相互作用的核苷酸和结构存在差异：预测 C mt-TR 的 T 环 G54 与 D 环相互作用；预测 H mt-TR 的 T 环 U57 与 D 环相互作用；预测 C mt-TR 的 U54/G55 都与 T 环的 A17 特异性相互作用。tRF 模式在肝脏组织中列出了特定的预测键合和核苷酸中心之间的距离。pIDDT，预测局部距离差异测试。关闭模态框

**讨论**

总体而言，这些发现确立了以前未表征的线粒体 tRFs 的存在，其表达模式受线粒体基因型、组织和性别的影响。数据支持一个模型，其中 mtDNA 多态性调节 tRNA 结构和切割，产生具有潜在调控活性的不同小 RNA 物种。阐明这些线粒体 tRFs 的生物发生、相互作用伙伴和功能后果对于理解线粒体遗传变异如何有助于转移至关重要。

**数据可用性**

RNA 测序数据已存储在基因表达综合数据库 (GEO; 预处理小 RNA 测序的 GEO 登录号 GSE324681; RealSeq 小 RNA 测序的 GEO 登录号 GSE324706)。处理后的代谢组学数据可通过交互式热图在 https://maayanlab.cloud/clustergrammer/viz_sim_mats/69a61efb1e6cf6050d0a600b/clustering%20input.txt 获取。图像、代谢组学数据和其他数据可从作者处获取。

作者披露

E. Schueddig 报告称，在研究进行期间，获得了国家总医学研究所的资助。D.C. Koestler 报告称，在研究进行期间，获得了国家癌症研究所和国家总医学研究所的资助。A.D. Scheid 报告称，在研究进行期间，获得了堪萨斯州 IdEA 生物医学研究卓越网络的资助。Y. Jing 报告称，在研究进行期间，获得了国家癌症研究基金的资助。I. Rigoutsos 报告称，在研究进行期间，获得了 NIH、METAvivor 和国家癌症研究基金的资助，此外还有一项关于“使用转运 RNA (tRNAs) 的组合物和方法”的待批准专利，以及一项关于“对 32 种 TCGA 癌症的系统级分析揭示了疾病依赖性的 tRNA 片段化模式以及与信使 RNA 和重复序列的非常选择性关联”的已授权专利。D.R. Welch 报告称，在研究进行期间，获得了国家癌症研究基金、Metavivor 公司、Alison's Allies 和 NIH/NCI 的资助，以及来自 Hall 家族讲席教授职位的其他资助。其他作者未报告任何披露事项。

作者贡献

K.L. Swancutt：构思，资源，数据整理，形式分析，监督，资金获取，调查，可视化，方法论，写作 – 初稿，写作 – 审查和编辑。R.M. Walsh：构思，数据整理，调查，方法论，写作 – 初稿，写作 – 审查和编辑。S. Quijano：构思，数据整理，调查，方法论，写作 – 初稿，写作 – 审查和编辑。E. Schueddig：形式分析，可视化，写作 – 初稿，写作 – 审查和编辑。D.C. Koestler：构思，数据整理，形式分析，可视化，方法论，写作 – 审查和编辑。A.D. Scheid：构思，数据整理，方法论，写作 – 审查和编辑。T.V. Bush：构思，资源，数据整理，软件，形式分析，监督，调查，方法论，写作 – 初稿，项目管理，写作 – 审查和编辑。Y. Jing：数据整理，调查，方法论，写作 – 初稿。I. Rigoutsos：构思，资源，数据整理，软件，形式分析，监督，调查，可视化，方法论，写作 – 初稿，项目管理，写作 – 审查和编辑。D.R. Welch：构思，资源，数据整理，形式分析，监督，资金获取，调查，可视化，方法论，写作 – 初稿，写作 – 审查和编辑。

致谢

我们衷心感谢 METAvivor 公司、国家癌症研究基金、Alison's Allies、分子医学 Hall 家族讲席教授职位以及 NIH (CA168524, GM103418, GM130423, OD036343, CA280575, HG012784, and UL1 TR00266) 为本项目提供的资助。几个共享资源的专业知识对这些研究做出了贡献：堪萨斯大学癌症中心的生物统计学共享资源 (CA168524)、DNA 测序核心 (S10 高端仪器资助 (S10 OD036343)) 以及 Frontiers CTSA 资助 (UL1 TR002366)。本出版物中使用的计算节点和高性能计算存储由堪萨斯大学癌症中心 (P30 CA168524)、堪萨斯州 IdEA 生物医学研究卓越网络 (GM103418) 和堪萨斯精准医学研究所 (GM130423) 提供支持。作者感谢几位优秀的医学、本科和高中学生在报告实验执行过程中参与方法故障排除的努力：Gabrielle Fisette, Raymond Preston, Christian Foster, Andrew Wegner, Kevin Jiang, Reid Minto, and Gonzalo Serrano Alderete。注：本文的补充数据可在 Cancer Research Communications Online (https://aacrjournals.org/cancerrescommun/) 获取。