线粒体tRNA衍生的片段作为可能的调控转移的RNA分子

《Cancer Research Communications》：Mitochondrial tRNA-Derived Fragments as Candidate Metastasis-Modifying RNA

　　**打开图形查看器**

**摘要**

线粒体DNA (mtDNA) 多态性如何影响复杂表型目前尚未得到充分理解。之前我们利用线粒体-核交换小鼠证明，mtDNA单核苷酸多态性 (SNP) 独立于代谢差异之外，影响转移性、心血管疾病和表观遗传标记。唯一与这些表型相关的mtDNA SNP位于编码线粒体转移RNA (tRNA)-精氨酸 [mt-tRNAArg (UCG), mt-TR] 的基因中，这表明非蛋白质编码位点可能也起着作用。在本研究中，我们识别并初步表征了从mt-TRs生成的先前未描述过的tRNA衍生片段 (tRFs)。Northern印迹实验显示，不同的mtDNA SNP、不同的组织（肺和肝）以及不同的性别之间存在差异表达的tRFs。令人惊讶的是，未经处理的RNA的小RNA测序并未检测到高丰度的相同tRFs。然而，通过去甲基化和恢复5′-OH及3′-PO4末端后，能够检测到与Northern印迹条带一致的序列。通过与线粒体基因组的精确匹配并进行归一化处理，发现了具有共同切割位点的潜在tRF序列。基于mtDNA SNP之间的关联、由此产生的SNP依赖性tRFs以及SNP与转移性之间的相关性，我们提出这些tRFs可能作为转移性修饰因子发挥作用。这些数据还扩展了线粒体基因组能够影响表型的功能范围。

**重要性：**本研究描述了被认为调控转移效率的线粒体tRNA片段的鉴定和初步表征。

**引言**

Hunter及其同事（1）通过将雄性MMTV-PyMT小鼠（FVB/N背景）与不同近交系雌性小鼠杂交，证明了遗传背景会影响转移效率。我们假设来自线粒体DNA (mtDNA)的母系遗传修饰因子可能至少部分解释了他们的观察结果（2-4）。为了将线粒体基因型作为独立的实验变量，我们生成了线粒体-核交换 (MNX) 小鼠（5, 6），从而能够系统评估mtDNA对肿瘤表型的影响。线粒体多态性以依赖于致癌驱动因子的方式，对肿瘤形成和转移性产生内在和外在的变化（3, 4）。来自实验和临床样本的累积数据表明mtDNA影响多种复杂表型（2, 6-11）；然而，其具体机制仍不清楚。由于线粒体在代谢中的核心作用，且线粒体基因组仅编码13种蛋白质（全部参与电子传递机制），我们对700多种代谢物进行了代谢组学分析。未观察到MNX小鼠肺或乳腺组织因mtDNA变异而发生的全球性代谢变化。正如预期的那样，代谢物主要按核基因型分组（补充图S1）。这些关于广泛代谢重组的空白发现表明，mtDNA可能通过超出经典生物能量的机制影响转移性（3, 4）。结合核DNA甲基化位点上的有限且离散的变化（8），我们假设线粒体基因组的非蛋白质编码转录本可能作为转移性修饰因子。对MNX和野生型线粒体基因组中的单核苷酸多态性 (SNP) 进行比较分析，发现了一个在线粒体转移RNA (tRNA) 精氨酸 [mt-tRNAArg (UCG) 中存在基因型依赖性的插入和缺失位点（以下简称mt-TR；图1A-C）。我们推测mt-TR中的SNP调节tRNA切割产物的生成——这些小非编码RNA被称为tRNA衍生片段 (tRFs；参考文献12-14），它们可能影响转移所需的各种生物过程。同样，含有不同SNP的tRFs可能对表型产生差异影响。

**图1：** MNX和野生型小鼠线粒体基因组中的SNP与肝组织中的tRF模式相对应。A. 相对于C57BL/6J小鼠线粒体基因组 (NC005089.1)，编码位点7778、8889、9348、9461和11780的SNP以及编码tRNAArg (mt-TR) 的基因存在于C3H/HeJ (CM004255.1) 和FVB/NJ (CM004184.1) 的基因组中。B. 不同品系中，核苷酸位置9820附近的SNP位于mt-TR D环内（红色）。C. C (C57BL/6J)、H (C3H/H3J) 和F (FVB/NJ) 品系的mt-TR全长序列，从5′到3′方向书写，并包括转录后添加的3′末端胞嘧啶-胞嘧啶-腺嘌呤 (CCA) 尖峰。Northern印迹杂交探针靶向的区域如下：中间带下划线的区域被Probe R3结合，粗体区域被Probe R4结合，最远3′端的下划线区域被Probe R5结合。D-I. 根据mtDNA品系的不同，mt-TR的长度为71-73个核苷酸（注意D中的连接线），并通过Northern印迹使用Probe R3 (D和G)、R4 (E和H) 或R5 (F和I) 在雄性（D-F）或雌性（G-I）肝组织中检测到tRFs。

**tRFs** 已被证明是一类由成熟或前体tRNA精确切割产生的调节性小RNA（12-14）。主要从核编码tRNA中鉴定出的tRFs已被发现参与翻译抑制（15）、RNA沉默（16）、凋亡调节（17）以及癌症进展和转移（18-20）。尽管对核tRF生物学的认识逐渐加深，但线粒体基因组作为小调节性RNA的来源仍然未被充分探索。与核tRNA基因不同，线粒体tRNA作为多顺反子转录本的一部分被转录，缺乏内含子，并遵循tRNA标点规则进行加工，这表明可能存在独特的线粒体tRF生成途径（21-25）。在这里，我们报告了从含有SNP的线粒体tRNA中发现的先前未描述的tRFs的鉴定和初步表征。基于mtDNA SNP之间的关联、由此产生的SNP依赖性tRFs以及SNP与转移性之间的相关性，我们提出这些候选tRFs可能作为转移性修饰因子发挥作用。这些发现扩展了线粒体基因组的功能谱系，并提出了一个新框架，说明mtDNA变异可能通过这一途径影响小鼠模型和人类疾病中的癌症进展。

**材料与方法**

**动物**

MNX小鼠品系是通过将定义的近交系受精卵的核移植产生的，以创建核基因组和线粒体基因组不匹配的小鼠（5, 26）。MNX品系在内部繁殖，包括来自C57BL/6J (RRID:IMSR_JAX:000664)、C3H/HeN (RRID:MGI:2160972)、FVB/NJ (RRID:IMSR_JAX:001800) 和BALB/cJ (RRID:MGI:2161072) 背景的品系组合，野生型对照品系从商业供应商（The Jackson Laboratory或Inotiv，前身为Envigo）获得，并在运输后适应7天或更长时间。我们使用两位字母代码表示MNX品系，其中第一个字母表示核基因组品系，第二个字母表示mtDNA品系（C = C57BL/6J；H = C3H/HeN；F = FVB/NJ）。基因分型使用Extract-N-Amp Tissue PCR Kit (MilliporeSigma, XNAT2) 和GoTaq Green Master Mix (Promega, M712B) 进行。通过限制性片段长度多态性分析验证扩增子的线粒体背景，包括位点9461和9348的mtDNA SNP，使用BclI (New England Biolabs, R0160S) 或PflFI (New England Biolabs, R0595S) 进行消化（如前所述（3-6）。从5至15周大的健康成年动物中收集肺和肝组织，采用标准饲养方法维持，并通过颈椎脱位法实施安乐死。所有动物实验均获得堪萨斯大学医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。

**小RNA提取**

组织保存在RNAlater (Invitrogen, AM7024) 中，并在提取RNA前冷冻。根据制造商说明书使用mirVana miRNA Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, AM1560) 进行小RNA分离，但有一个例外：没有丢弃分离出的大RNA部分，而是将其保留下来，洗涤后通过琼脂糖凝胶电泳可视化28S和18S rRNA条带来评估RNA完整性。将完整的RNA样本通过醋酸钠-丙醇沉淀法沉淀，然后用70%乙醇洗涤，最后重新悬浮在无核酸酶的水中。使用Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Q32881) 测定RNA浓度。

**Northern印迹**

Northern印迹使用变性尿素-PAGE进行。将合并的小RNA（每条泳道5 μg）在70°C下变性5分钟后加载，然后迁移至15% 8 mol/L尿素-PAGE凝胶上，并电泳转移到尼龙膜上。膜经UV交联后，使用ULTRAhyb缓冲液（Invitrogen, AM8663）预杂交，随后在37°C下与3′端标记有digoxigenin (DIG)的锁定核酸（ssDNA）探针进行过夜杂交，这些探针均由Integrated DNA Technologies定制合成。测试并命名了以下针对mt-TR 5′到3′互补区域的探针序列：R1a: TTTTTAAACTAATTACCA，R1b（特异性针对C3H来源的mtDNA产物）：TTTTAAAACTAATTACCA，R2: AATCATTAATTTTTTTT，R3: AGTCGAAATCATTAATTTT，R4: CATAATCTAATGAGTCGAAA，R5: TGGTTGGTAATTATGAACA。经过高严格性和低严格性盐柠檬酸/SDS洗涤后，膜被封闭（Roche, 11585762001），并与碱性磷酸酶结合的抗-DIG抗体（Roche, 0335375910）孵育。应用CDP-Star底物（Sigma, C0712）后，通过数字成像（Azure 600；RRID:SCR_023780）检测化学发光信号。所有印迹的曝光时间（5分钟手动）均用于便于比较。使用结合了蓝色标记物的DIG标记RNA梯度来估算tRNA和tRF的大小（DiagnoCine, FNK-DM270）。使用针对5S rRNA的探针（AAGCCTACAGCACCCGGTATT）在单独的印迹中评估合并RNA样本的质量。全长mt-TR被视为内参转录本，用作方便的加载对照。

**tRFs** 的发现**

tRFs是一类由成熟或前体tRNA精确切割生成的调节性小RNA（12-14）。最初主要研究的是核编码的tRNA，tRFs已被证实参与翻译抑制（15）、RNA沉默（16）、凋亡调节（17）以及癌症进展和转移（18-20）。尽管对核tRF生物学的认识逐渐增加，但线粒体基因组作为小调节性RNA的来源仍未被充分探索。与核tRNA基因不同，线粒体tRNA作为多顺反子转录本的一部分被转录，没有内含子，并按照tRNA标点规则进行加工，这提示可能存在不同的生物生成途径产生独特的线粒体tRFs（21-25）。在这里，我们报告了从含有SNP的线粒体tRNA中发现的先前未描述的tRFs的鉴定和初步表征。基于mtDNA SNP之间的关联、由此产生的SNP依赖性tRFs以及SNP与转移性之间的相关性，我们提出这些候选tRFs可能作为转移性修饰因子发挥作用。这些发现扩展了线粒体基因产物的功能范围，并提出了一个新的框架，说明mtDNA变异可能通过这一途径影响小鼠模型和人类疾病中的癌症进展。小鼠小非编码RNA的组织图谱（GSE119661）被用来比较公共数据中与mt-TR对齐的序列（28）。表1显示了通过RNA测序确定的候选tRF序列与mt-TR的对齐情况。以下是各菌株的序列信息：

| 菌株 | 片段序列 | 平均mt-TR标准化读取次数 |
|---------|----------------------------------|---------------------|
| CC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 172,576 |
| HCT | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 120,712 |
| GG | TTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 57,70 |
| TTG | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATT | 23,131 |
| ATT | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATT | 10,32 |
| CHT | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATT | 9,48 |
| HH | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATT | 8,73 |
| FF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 8,50 |
| CFT | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 6,75 |
| HH | TGGTAATTAGTTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 31,224 |
| CHT | TGGTAATTAGTTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATTATGATGA | 22,326 |
| FF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTAGATT | 13,14 |
| CB | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 13,05 |
| CC | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 10,70 |
| CFT | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 10,51 |
| HH | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 10,24 |
| CHT | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 9,61 |
| FF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 8,13 |
| CB | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 7,98 |
| FF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 241,04 |
| CB | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 96,76 |
| CF | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 41,78 |
| CB | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 16,12 |
| CB | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 14,83 |
| CB | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 9,15 |
| HH | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATT | 9,04 |
| CB | TGGTAATTAGTTTAAAAAAAAATTAATGATTTCGACTCATTA | 8,51 |
| HH | TGGTAATTAGTTTAAAATTAATGATTTCGACTCATTA | 8,35 |

注：tRF序列是根据来自雌性小鼠肝脏的预处理后小RNA样本，按照与mt-TR标准化读取次数的降序排列的。mt-TR标准化读取次数是通过对具有相同mtDNA基因组的菌株的重复实验结果进行平均得出的，并且只包括了那些与Northernblot结果一致的假定的tRF序列（见图1G–I）。

**tRNA结构建模**

每个菌株（C: C57BL/6J, H: C3H/HeJ, F: FVB/NJ）的mt-TR序列被输入到AlphaFold3（29, 30）中，以预测由于SNP导致的潜在结构变化。由于对未修饰结构的预测信心较低，因此在建模中包含了已知的人类mt-TR修饰，包括位置9和16的m1A、位置10的2N-甲基鸟苷（m2G）以及位置29和36的假尿苷（Ψ）（31），以提高折叠预测的准确性。

**mt-TR基因中的SNP与tRF生成的相关性**

尽管线粒体基因组的规模较小，但其多态性仍然影响多种生物过程，包括转移性进展（3, 4, 11），这些过程可能由tRF介导（3, 4, 8–11, 19）。由于tRF代表了一类独特且日益被认可的调控性小RNA，我们研究了mt-TR是否也可能产生先前未表征的RNA种类。通过Northern blotting技术，并最初关注常发生转移的组织，我们在雄性小鼠肝脏中识别出了来自mt-TR的离散RNA条带模式（见图1D–F）。这些片段在基础条件下可以被检测到，在细胞应激条件下则没有被检测到。使用设计用来捕获最可能的tRF物种（即内部tRF或“i-tRF”（25）的杂交探针时，当靶向mt-TR的中部区域（CC和HC菌株中的位置18到36，FF和CF菌株中的位置19到37，HH和CH菌株中的位置20到38，探针R3，见图1C）时，观察到tRF条带的多样性最大。重要的是，具有相同线粒体基因组的菌株之间的条带模式更为相似（在图1D中最为明显），这表明mtDNA背景影响了片段的丰度和/或加工过程。当杂交探针的靶标区域向3’端移动11个核苷酸（探针R4，见图1E）时，仍能检测到一些片段。此外，还一致观察到长度小于约50个核苷酸的RNA物种。相比之下，针对mt-TR 3’端的杂交没有检测到任何片段（探针R5，见图1F）。在雌性肝脏（见图1G–I）以及雄性（见图2A–C）和雌性肺部（见图2D–F）中也检测到了类似的tRF物种。然而，在所有组织和性别中，探测mt-TR的3’末端未能检测到相应的较小RNA（见图24）。不过，我们的发现加强了这样一种可能性：即来自转录本5’和内部区域的稳定片段确实存在（根据现有术语称为“5’-tRF”，参考文献25）。条带强度表明片段丰度可能因线粒体基因型、组织和性别而异（在图2G和H中进行了直接比较）。图2显示了tRF模式在不同组织和性别之间的一致性，但在不同组织和性别之间存在差异。

总的来说，观察到的主要tRF物种长度约为50个核苷酸，这与从3’末端去除大约20个核苷酸的情况相符。这个50个核苷酸的片段包含了mt-TR的5’和中间部分，比RNA测序平台通常检测到的典型5’半部分tRF物种要大。未检测到代表19到21个核苷酸片段的条带表明这些片段可能快速降解，或者其丰度低于我们的Northern blotting协议的检测限。尽管如此，通过miRNA特异性文库制备仍可以扩增和测序这些片段（补充表S1）。基于这些发现，我们提出了一种模型：mtDNA的SNP改变了mt-TR的结构，可能影响了tRF生物生成过程中的核酸酶可及性和切割模式，这与Northern blotting观察到的菌株特异性片段模式和丰度差异一致，并且与mtDNA相关的转移负担相关。

**来自mt-TR的tRF在转录后经过修饰并在特定位置被切割**

为了确定从mt-TR切割出的tRF的序列，我们首先使用先前经过验证的miRNA分析方法（27）进行了小RNA测序，包括单接头和环化制备技术。然而，这初步尝试未能检测到通过Northern blotting观察到的适当大小的mt-TR片段（数据可在GSE324706获取）。tRNA经历了广泛的修饰，包含甲基化碱基和其他化学改变（31）。内切核糖核酸酶（例如angiogenin、RNase T2或RNase A超家族成员）的切割可能会产生具有非典型5’和/或3’末端的片段（22, 32, 33）。因此，我们引入了酶法修复末端，以恢复5’-磷酸和3’-羟基基团，并使用ArrayStar试剂盒对选定核苷进行去甲基化。需要注意的是，包含未修复修饰的片段仍可能逃避检测。tRNA和tRF测序的定量解释受到多种技术偏倚的影响，这些偏倚既影响检测也影响表观丰度。tRNA中的转录后修饰，如m1A和m2G残基（31），可能会通过提前终止、错误掺入或可变读取深度等方式干扰逆转录过程，从而扭曲tRF的回收和序列准确性（34）。尽管去甲基化策略可以在一定程度上缓解这些障碍，但反应效率未知，并且可能会引入由α-酮戊二酸和亚铁离子介导的Fenton化学反应，这可能会独立于其生物学来源富集较短片段（35）。此外，tRF末端的化学异质性、持续的二级结构以及接头连接、大小选择和PCR扩增的偏差共同导致了文库组成的序列和结构依赖性偏差。较短的读长也使得唯一配对变得复杂，特别是在高度同源的tRNA基因和线粒体-核序列旁系物之间，从而增加了读段分配的不确定性（36）。为了提高预测的准确性并更好地反映已知的tRNA折叠原理（37），我们根据报道的人类mt-TR的转录后修饰（m1A、m2G；Ψ：假尿苷）对每个菌株的序列进行了建模。这些因素表明，通过RNA测序观察到的tRF丰度应被视为生物学信号和选择性技术可检测性的函数，而不仅仅是细胞内RNA水平的严格定量测量。与使用Northern blotting等金标准方法的直接观察相比，RNA测序无论是否经过酶处理，都很可能在数量上有所低估。经过末端修复和去甲基化后，仅部分解决了tRNA和tRF测序的复杂性问题，几个候选片段被唯一地映射到mt-TR（补充表S1）。虽然这些片段序列偶尔可以在小鼠肺部或肝脏的公共数据中找到，但在预处理数据中其典型丰度（每百万读数）有所提高。当这些片段序列根据mt-TR的读取次数进行归一化后，尽管存在mtDNA SNP，最常见的物种在所有菌株中具有相同的切割位点，但总长度依赖于SNP（表1），这支持了这些RNA是主动且可重复产生的结论，而不是降解产物，因为RNA blotting在后者情况下会显示出模糊的条带。聚焦于主要片段的预测切割位点，AlphaFold3（29, 30）对所有三个菌株的mt-TR进行了预测建模，在D–T环相互作用区域显示了这个位点周围的相对稳定性和置信度最低（见图3A和B）。mt-TR的预测结构显示了腺嘌呤（52–54）和尿嘧啶（53–55）在T环中的潜在差异暴露和稳定性（补充图S2；补充表S2）。我们推测，菌株特异性mt-TR的差异D–T环相互作用可能会影响该位置的稳定性和切割敏感性，这需要在未来的研究中进一步探讨。图3显示了mt-TR的不同稳定性和D–T环结构。作者披露

E. Schueddig 在研究期间接受了美国国家普通医学科学研究院（National Institute for General Medical Sciences）的资助。D.C. Koestler 在研究期间接受了美国国家癌症研究所（National Institute of Cancer）和美国国家普通医学科学研究院的资助。A.D. Scheid 在研究期间接受了堪萨斯州生物医学研究卓越网络（Kansas IdEA Network of Biomedical Research Excellence）的资助。Y. Jing 在研究期间接受了美国国家癌症研究基金会（National Foundation for Cancer Research）的资助。I. Rigoutsos 在研究期间接受了美国国立卫生研究院（NIH）、MetAvivor公司以及美国国家癌症研究基金会的资助；同时还拥有一项关于使用转运RNA（tRNAs）的专利申请，以及一项关于32种TCGA癌症的系统级分析的专利，该分析揭示了疾病依赖性的tRNA碎片化模式及其与信使RNA和重复元件的选择性关联。D.R. Welch 在研究期间接受了美国国家癌症研究基金会（National Foundation for Cancer Research）、Metavivor公司、Alison’s Allies组织以及NIH/NCI的资助，此外还获得了Hall家族教授职位的资助。其他作者未披露任何资助信息。

作者贡献

K.L. Swancutt：概念构思、资源提供、数据管理、数据分析、监督、资金筹集、研究实施、数据可视化、方法论设计、初稿撰写、审稿与编辑工作。
R.M. Walsh：概念构思、数据管理、研究实施、方法论设计、初稿撰写、审稿与编辑工作。
S. Quijano：概念构思、数据管理、研究实施、方法论设计、初稿撰写、审稿与编辑工作。
E. Schueddig：数据分析、数据可视化、初稿撰写、审稿与编辑工作。
D.C. Koestler：概念构思、数据管理、数据分析、数据可视化、方法论设计、初稿撰写、审稿与编辑工作。
A.D. Scheid：概念构思、数据管理、方法论设计、初稿撰写、审稿与编辑工作。
T.V. Bush：概念构思、资源提供、数据管理、软件开发、数据分析、监督、研究实施、方法论设计、项目协调、初稿撰写、审稿与编辑工作。
Y. Jing：数据管理、研究实施、方法论设计、初稿撰写工作。
I. Rigoutsos：概念构思、资源提供、数据管理、软件开发、数据分析、监督、研究实施、数据可视化、方法论设计、初稿撰写、项目协调、审稿与编辑工作。
D.R. Welch：概念构思、资源提供、数据分析、数据分析、监督、资金筹集、研究实施、数据可视化、方法论设计、初稿撰写、审稿与编辑工作。

致谢

我们衷心感谢METAvivor公司、美国国家癌症研究基金会（National Foundation for Cancer Research）、Alison’s Allies组织、Hall家族分子医学教授职位（Hall Family Professorship in Molecular Medicine）以及美国国立卫生研究院（NIH）对这项研究的资助（项目编号：CA168524、GM103418、GM130423、OD036343、CA280575、HG012784、UL1 TR00266）。多项共享资源的专业支持也促成了这些研究的顺利进行，包括堪萨斯大学癌症中心（University of Kansas Cancer Center）的生物统计学共享资源（项目编号：CA168524）、DNA测序核心设施（S10高端仪器资助项目：S10 OD036343）以及Frontiers CTSA资助项目（UL1 TR002366）。本文中使用的计算节点和高性能计算存储资源得到了堪萨斯大学癌症中心（P30 CA168524）、堪萨斯州生物医学研究卓越网络（GM103418）和堪萨斯精准医学研究所（GM130423）的支持。作者们还要感谢许多优秀的医学生、本科生和高中生在实验过程中的帮助，他们在数据处理和问题解决方面发挥了重要作用，这些人包括Gabrielle Fisette、Raymond Preston、Christian Foster、Andrew Wegner、Kevin Jiang、Reid Minto和Gonzalo Serrano Alderete。补充数据可访问Cancer Research Communications Online网站（https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）。