《Nature Structural & Molecular Biology》：A single-amino-acid cleavage controls global mitochondrial complex integrity
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线粒体蛋白质稳态（proteostasis）依赖于输入前体蛋白的精确N端加工。该成熟步骤的缺陷与疾病相关，但其在人类中的功能影响仍不清楚。研究人员发现，移除单个氨基酸的中间切割肽酶ICP55作为多聚体线粒体蛋白复合物的关键稳定因子发挥作用。利用蛋白质组学和复合
线粒体蛋白质稳态（proteostasis）依赖于输入前体蛋白的精确N端加工。该成熟步骤的缺陷与疾病相关，但其在人类中的功能影响仍不清楚。研究人员发现，移除单个氨基酸的中间切割肽酶ICP55作为多聚体线粒体蛋白复合物的关键稳定因子发挥作用。利用蛋白质组学和复合物分析（complexome profiling），研究人员鉴定了超过100个人类ICP55底物，并证明ICP55缺失引发蛋白质组装体的广泛去稳定化，并伴随整体向更小子复合物的偏移。因此，研究人员揭示了一种保守的翻译后机制，该机制通过单氨基酸切割调控复合物完整性以维护线粒体蛋白质稳态，并提出N端蛋白形式控制（N-terminal proteoform control）是细胞器稳态中一个此前未被认识到的调控层面。
论文解读：ICP55介导的N端加工维护线粒体复合物完整性
研究背景与问题：线粒体是参与能量转换、生物合成和信号转导的关键细胞器，其功能障碍与多种人类疾病密切相关。绝大多数线粒体蛋白由核基因编码，在胞质中合成后以前体形式输入线粒体，其N端含有线粒体靶向信号（MTS）。进入基质后，线粒体加工肽酶（MPP）切除前序列，随后中间切割肽酶ICP55进一步移除单个氨基酸，产生稳定的N端。然而，该顺序加工过程主要基于酵母研究，其在人类线粒体中的生理意义仍不清楚。已知MPP亚基PMPCA、PMPCB、MIP和ICP55的突变与严重神经退行性变、心肌病和肾病相关，但缺陷性N端加工导致的具体分子后果尚不明确。此外，现有计算预测工具基于酵母和植物数据训练，可能无法识别人类特异的切割位点和底物。因此，研究人员系统解析了人类ICP55的底物谱及其对线粒体复合物完整性的影响。
研究内容与结论：研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了ICP55敲除（ICP55KO）HEK293T细胞，结合高分辨率N端组学、定量蛋白质组学、SILAC复合物分析、蓝绿温和电泳、线粒体呼吸测量及重组蛋白体外组装实验，系统描绘了人类线粒体N端加工图谱。共鉴定446个带有可切割N端的线粒体蛋白，其中107个为高置信度ICP55底物，并发现精氨酸（R）和谷氨酰胺（Q）作为新的切割位点决定残基。功能研究表明，ICP55缺失导致呼吸链复合物、HSP60伴侣复合物、线粒体核糖体等多种多聚体复合物稳定性下降，整体向小分子量亚复合物偏移。体外实验证实，单个额外N端残基足以破坏HSP60复合物稳定性。该研究揭示了N端蛋白形式控制作为细胞器稳态中一个被低估的调控层面，为理解线粒体疾病机制提供了新视角。论文发表在《Nature Structural》。
主要技术方法：研究人员使用人类胚胎肾细胞系HEK293T（野生型和ICP55KO），采用基于十一醛的N端肽段高效富集（HUNTER）联合质谱进行N端组学分析；通过稳定同位素标记（SILAC）结合蓝色温和电泳（BN-PAGE）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行复合物分析（complexome profiling）；运用SDS-PAGE和BN-PAGE结合免疫印迹评估蛋白复合物组装和稳定性；使用Seahorse分析仪测量氧消耗率（OCR）评价线粒体呼吸功能；利用重组HSP60体外组装和尺寸排阻色谱（SEC）检测寡聚体稳定性；使用AlphaFold3进行结构预测。样本来源为HEK293T细胞，未涉及患者队列。
研究结果：
**全局N端组学鉴定ICP55底物谱及额外切割基序**：通过HUNTER比较WT和ICP55KO线粒体N端肽段，鉴定出107个高置信度ICP55底物，其中29个未被现有预测算法识别。分析切割位点两侧氨基酸频率，发现R和Q也可作为ICP55切割的底物决定残基，扩展了已知的酪氨酸（Y）、亮氨酸（L）、苯丙氨酸（F）基序。结果表明人类ICP55底物谱远比酵母已知的约50个底物广泛，顺序N端加工在人类线粒体中可能更为普遍。
**单个N端残基滞留破坏呼吸链复合物完整性**：定量蛋白质组学显示ICP55KO线粒体中呼吸链组装因子SDHAF2和COX7A2L水平显著上升，但BN-PAGE免疫印迹显示呼吸链超复合物丰度明显降低，而外膜TOM复合物不受影响。用尿素挑战蛋白间相互作用后，ICP55KO线粒体中ETC各复合物更易解离，同时细胞耗氧率降低。重新表达ICP55可恢复超复合物组装和呼吸功能。结论：ICP55缺失导致呼吸链复合物结构不稳定，其原因是多个ETC亚基N端保留额外氨基酸，削弱了蛋白间相互作用。
**ICP55缺失降低线粒体HSP60复合物稳定性**：BN-PAGE分析显示，ICP55KO线粒体中HSP60寡聚体组装显著减少，并出现低分子量单体条带，而总蛋白水平不变。放射性标记的HSP60前体导入实验显示，线粒体导入不受影响，但新导入HSP60组装为成熟桶状结构的速度轻度降低。尿素浓度梯度处理表明，ICP55KO线粒体中HSP60复合物在温和变性条件下即快速解聚，而重新表达ICP55可恢复稳定性。结论：未加工的HSP60掺入导致伴侣素复合物结构不稳定。
**复合物分析揭示ICP55KO线粒体中呼吸链复合物和HSP60组装的去稳定化**：采用SILAC结合BN-PAGE和质谱的复合物分析，获得2989个蛋白的分布谱，其中933个为线粒体蛋白。在WT线粒体中HSP60主要形成约450 kDa的单一峰，而ICP55KO中呈现双峰分布，新增约120 kDa的峰，对应未组装或解离的HSP60。呼吸链复合物I、II、III、IV的代表性亚基（NDUFB11、SDHC、UQCRC2、COX5A）在ICP55KO中均出现低分子量亚复合物增多，同时成熟超复合物减少。结论：定量复合物分析证实ICP55缺失导致呼吸链和HSP60复合物稳定性下降。
**ICP55缺失全局破坏线粒体复合物完整性**：通过统计迁移谱差异（dis-elution评分），鉴定出177个线粒体蛋白的复合物谱在ICP55KO中显著改变，主要定位于基质和内膜。轨迹图分析显示，高分子量复合物丰度普遍降低，而低分子量额外峰增加。基因本体（GO）富集分析表明，受影响的生物过程主要集中在氧化磷酸化、呼吸链生物发生和线粒体翻译；细胞组分富集包括线粒体呼吸体、内膜蛋白复合物、基质和线粒体核糖体。进一步分析显示，线粒体核糖体大亚基（如MRPL44）和小亚基（如MRPS23）的主峰丰度下降，低分子量峰增加；异柠檬酸脱氢酶复合物（含ICP55底物IDH3A和IDH3B）也出现组装减少。结论：ICP55缺失导致线粒体蛋白复合物整体向更小组装体偏移，广泛破坏复合物结构。
**单个额外N端残基足以使线粒体蛋白复合物不稳定**：AlphaFold3预测显示，HSP60 N端额外酪氨酸面向HSP60/HSP10复合物内部，与同一亚基及相邻亚基的C端产生接触，可能破坏亚基间相互作用。体外重组表达仅N端第一个残基不同（成熟形式为丙氨酸，中间形式为酪氨酸）的HSP60，经ATP依赖组装后通过SEC分离寡聚体。在第二次SEC分析中，中间形式HSP60虽然初始可形成寡聚体，但迅速解聚为单体，而成熟形式保持稳定。BN-PAGE分析确认解聚发生在溶液相而非电泳过程中。结论：单个额外N端残基足以直接导致HSP60复合物不稳定。
讨论总结与结论翻译：讨论部分指出，该研究确立了N端加工作为线粒体复合物完整性的核心决定因素。实验鉴定的底物中有近三分之一被传统预测算法遗漏，凸显了直接实验方法的必要性。机制上，保留单个N端残基可能削弱紧密的亚基界面，导致新生复合物组装受损和成熟复合物加速解离。COX7A2L上调可能是代偿反应，但无法克服N端加工缺陷带来的主导性去稳定效应。HSP60的N端额外酪氨酸与已知致病突变D3G在机制上平行，提示微小N端改变即可损害伴侣功能。研究还提出，未组装的亚基若保留额外N端残基，可能通过类似N端规则的机制被选择性降解。ICP55缺陷患者的神经、心脏和肾脏症状可能与必需线粒体复合物稳定性受损及蛋白质稳态破坏有关，轻度加工缺陷可能参与迟发性线粒体疾病。结论翻译：总之，该研究将ICP55定位为人类线粒体中关键的蛋白质稳态保护因子，通过精确的N端成熟确保基质和内膜多聚体复合物的结构稳定性。研究人员提出，N端蛋白形式控制是线粒体蛋白质稳态中一个此前未被充分认识的调控层面，对细胞器健康和疾病具有广泛意义。此外，该研究整合计算与实验的方法为绘制其他细胞器加工蛋白酶的底物谱提供了通用蓝图，有助于理解蛋白酶特异性与复杂蛋白网络的共进化。
