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•溶血法和密度梯度离心是从结直肠癌患者外周血中分离循环肿瘤细胞（CTCs）的有前景的方法。•溶血法产生的 CTCs 产量高于密度梯度离心。•密度梯度离心在保持 CTCs 形态完整性方面更有效。•PLS3 被确认为检测具有转移潜能的 CTCs 的可靠标志物。引言结直肠癌是印度尼
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溶血法和密度梯度离心是从结直肠癌患者外周血中分离循环肿瘤细胞（CTCs）的有前景的方法。
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溶血法产生的 CTCs 产量高于密度梯度离心。
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密度梯度离心在保持 CTCs 形态完整性方面更有效。
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PLS3 被确认为检测具有转移潜能的 CTCs 的可靠标志物。
引言
结直肠癌是印度尼西亚第二常见的癌症类型。在印度尼西亚每 10 万人口中，19.1% 的男性和 15.6% 的女性患有结直肠癌病例，平均年龄范围为 40 至 50 岁，死亡率主要由 50 岁及以上的老年人主导。为了降低高死亡率，需要进行早期检测努力。结直肠癌检测可以通过多种方法进行，其中一种是液体活检（Abdullah 等，2012）。使用外周血的液体活检是一种半侵入性的结直肠癌检测和诊断方法，与结肠镜检查程序相比（Mazouji 等，2021）。癌症患者的外周血含有与原始肿瘤特性相关的遗传物质信息，例如循环肿瘤细胞（CTCs）（Roumeliotou 等，2022）。无论处于早期还是晚期阶段，CTCs 的计数对于深入了解癌症患者的预后和治愈计划都很重要（Heidrich 等，2021）。
依赖标签的检测方法（如免疫磁珠法）通常用于通过利用磁性纳米珠偶联抗体与细胞表面抗原之间的相互作用来分离 CTCs。该选择利用细胞特异性表面蛋白的表达，如上皮细胞粘附分子（EpCAM）和细胞角蛋白（CKs），例如 CK20 蛋白，它是结直肠癌的特异性标志物，因为在使用免疫荧光方法表征结直肠癌细胞时其具有高发光表达（Florescu-Tenea 等，2019）。然而，CTCs 上的上皮标志物表达可被上皮 - 间质转化（EMT）过程抑制，因此不表达这些标志物的 CTCs 可能无法被检测到（Baek 等，2019，Lin 等，2021）。
这些局限性导致了基于生物物理特性或具有高捕获灵敏度的无标签检测替代 CTC 分离方法的发展，例如密度梯度和溶血法。密度梯度离心利用细胞密度的差异，能够从血浆和红细胞中分离各种淋巴细胞亚型和循环肿瘤细胞（CTCs）。相比之下，溶血法通过选择性裂解红细胞来分离 CTCs。这两种技术都提供了有效的分离，机械破坏最小，从而保留细胞表面受体以供后续分析（Micalizzi 等，2017）。根据之前的研究，使用不依赖细胞抗原表达的 CTC 分离方法可能有助于降低检测 CTCs 的难度。此外，在使用免疫荧光方法进行的 CTC 表征研究中，观察到 CTCs 中存在的 Plastin-3（PLS3）蛋白与结直肠癌特异性标志物 CK20 共表达，并显示出这两种标志物与转移潜能的关联（Nasaif 和 Al Qallaf, 2018）。该研究将 PLS3 与肿瘤细胞侵袭性和上皮 - 间质转化联系起来，表明其在检测侵袭性癌症表型方面的潜力。相比之下，CK20 由于其对结直肠来源上皮细胞的高特异性，被广泛用于结直肠癌诊断。在本研究中，我们比较了溶血法和密度梯度法在从结直肠癌中分离 CTCs 的潜力。我们还评估了 PLS3 作为结直肠癌 CTCs 有效新型生物标志物的价值。
章节摘要
受试者
外周血采集自印度尼西亚雅加达吉波·曼贡库苏摩医院的结直肠癌患者。纳入标准如下：（1）受试者年龄在 18 至 80 岁之间；（2）基于内镜检查结果或 CT 扫描提示患有结直肠癌；以及（3）诊断为腺癌且愿意捐赠样本用于研究目的。所有参与者在入组前均签署了知情同意书。本研究已获得批准
CK20 和 PLS3 抗体浓度优化
抗体浓度的优化如图 1 所示。在 1:100 的稀释比例下，HT-29 细胞中 PLS3 和 CK20 均清晰表达，显示出轮廓清晰、圆润的形态和完整的细胞核。相比之下，在更高稀释度（1:200 和 1:500）下，荧光信号明显较弱，难以可靠地观察细胞结构和标志物表达。因此，选择了 1:100 的稀释度作为两种抗体的最佳浓度
结论
本研究证明了使用密度梯度离心和溶血法从结直肠癌患者外周血中分离 CTCs 的可行性。溶血法分离出的 CTCs 数量更多，而密度梯度离心更好地保留了 CTCs 的形态完整性。在分离出的 CTCs 中观察到 PLS3 和 CK20 共表达，表明 PLS3 作为 CTC 检测标志物的潜力。然而，鉴于样本量较小，这些发现
伦理批准
所有程序均遵守相关法律法规和机构指南，并已获得相应机构委员会的批准。本研究已于 2023 年 10 月 2 日获得印度尼西亚大学医学院伦理委员会批准，编号为 1280/UN2.F1.ETIK/PPM.00.02/2023。
知情同意
已遵守人类受试者的隐私权，并获得了知情同意。所有参与者在入组前均签署了知情同意书。
CRediT 作者贡献声明
Astari Dwiranti: 写作 - 审查与编辑，监督，资金获取，概念化。Anom Bowolaksono: 写作 - 审查与编辑，监督，概念化。Dimas Ramadhian Noor: 写作 - 审查与编辑，方法论，正式分析。Muhammad Risyad Fahreza: 写作 - 审查与编辑，正式分析。Murdani Abdullah: 写作 - 审查与编辑，监督，资金获取，概念化。Annisa Rahmani Putri: 写作 - 审查与编辑，写作 - 原稿
致谢
本研究由印度尼西亚大学研究资助与生态系统管理局提供的 PUTI 高影响力 2025 拨款资助，合同编号为 PKS-36/UN2.RST/HKP.05.00/2025。作者感谢大阪大学科学工业研究所（SANKEN）和前沿生物研究生院的金井武春教授（Takeharu Nagai），他提供了深刻的宝贵意见，极大地改善了本手稿。
Murdani Abdullah|Annisa Rahmani Putri|Dimas Ramadhian Noor|Muhammad Risyad Fahreza|Anom Bowolaksono|Astari Dwiranti
