《Tissue and Cell》：The Cytotoxic Effect of DEBIO 1143 on Triple-Negative Murine Breast Cancer Cell Lines: Insights from
In Vitro and
In Silico Studies
编辑推荐：
•DEBIO 1143 对 TNBC 显示出显著的细胞毒性作用。•DEBIO 1143 诱导非凋亡性细胞死亡的能力。•MD 模拟进一步支持了 DEBIO 1143 的细胞毒性机制。•DEBIO 1143 可能对三阴性乳腺癌的治疗有用。引言乳腺癌仍然是全球女性中诊断频率最高的恶
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DEBIO 1143 对 TNBC 显示出显著的细胞毒性作用。
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DEBIO 1143 诱导非凋亡性细胞死亡的能力。
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MD 模拟进一步支持了 DEBIO 1143 的细胞毒性机制。
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DEBIO 1143 可能对三阴性乳腺癌的治疗有用。
引言
乳腺癌仍然是全球女性中诊断频率最高的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一，其中三阴性乳腺癌 (TNBC) 约占所有病例的 15–20% (Agostini et al., 2018, Sung et al., 2021)。TNBC 在临床上定义为缺乏雌激素受体 (ER)、孕激素受体 (PR) 和人表皮生长因子受体 2 (HER2)，因此不适用传统的内分泌或抗 HER2 靶向治疗 (McCart Reed et al., 2019)。由于其临床病程具有侵袭性、内脏转移率高且早期复发，TNBC 代表了临床肿瘤学中的一个巨大挑战。尽管细胞毒性化疗存在相当大的毒性和治疗耐药性的迅速出现，它仍然是主要的全身治疗选择，这突显了对新型靶向策略的迫切需求。
支持 TNBC 细胞存活和治疗耐药性的关键机制是逃避程序性细胞死亡，这主要通过凋亡抑制蛋白 (IAPs) 的过表达介导 (Cong et al., 2019, Vucic and Fairbrother, 2007)。IAP 家族包括 cIAP1、cIAP2 和 XIAP，其特征是核型多角体病毒 IAP 重复 (BIR) 结构域，介导与促凋亡信号分子的相互作用。作为分子守门人，这些蛋白质通过直接抑制半胱天冬酶或阻止死亡诱导信号复合物的组装，对内在和外在凋亡途径施加了刹车 (Cong et al., 2019, Derakhshan et al., 2017)。在 TNBC 中，IAP 失调不仅促进肿瘤细胞存活，还导致标准化疗方案的失败 (LaCasse, 2020)。
第二线粒体衍生半胱天冬酶激活剂 (SMAC) 的小分子模拟物能够结合 IAPs 的 BIR 结构域并诱导其自泛素化和蛋白酶体降解，已成为恢复 IAP 过表达恶性肿瘤细胞死亡的有前途的制剂 (Bai et al., 2014, Fulda, 2015)。DEBIO 1143 (xevinapant; AT-406) 是一种强效、口服生物利用的第二代 SMAC 模拟物，已在几种癌症类型中进展到 I/II 期临床研究 (Derakhshan et al., 2017)。重要的是，DEBIO 1143 的治疗潜力不仅限于恢复凋亡。在凋亡机制受损的恶性肿瘤中，SMAC 模拟物可以将细胞重定向至其他非凋亡性调节细胞死亡途径，包括坏死性凋亡和自噬 (Thibault et al., 2018)。坏死性凋亡由 RIPK1/RIPK3/MLKL 信号轴执行，而自噬可以在 IAP 耗竭后作为协同的次要机制发挥作用 (Vega-Rubín-de-Celis et al., 2018)。因此，理解这些非经典途径之间的相互作用对于绕过侵袭性 TNBC 亚型内在的凋亡耐药性至关重要 (Bellaye et al., 2018, LaCasse, 2020)。
尽管 DEBIO 1143 的药理特性很有前途，但在小鼠 TNBC 模型中，从细胞存活向非经典细胞死亡转变的分子事件仍未得到充分表征。为了弥补这一知识空白，本研究采用了一个综合框架，结合体外实验和长时标 (1-μs) 分子动力学 (MD) 模拟，以评估 DEBIO 1143 在 4T1 和 4T1-HER2 细胞系中的多模式细胞毒性效应。具体而言，我们试图阐明配体 - 蛋白复合物的结构稳定性，以区分主要药理相互作用和次要细胞反应。通过将 cIAP1 降解和关键效应物 (RIP3、Beclin-1 和 LC3II) 上调的实验证据与计算结合动力学相关联，我们为 DEBIO 1143 克服 TNBC 治疗耐药性的能力提供了机制上的合理性。
据我们所知，这是首批通过平行体外–计算机策略系统表征 DEBIO 1143 诱导的小鼠 TNBC 模型非凋亡性调节细胞死亡的研究之一。我们假设 DEBIO 1143 将主要通过非凋亡途径发挥其细胞毒性作用——具体来说是由 cIAP1 耗竭间接触发的类似坏死性凋亡的细胞死亡和自噬，而不是通过直接作用于相应的下游效应物。为了验证这一假设，我们将 Annexin V/PI 流式细胞术、MDC 染色和关键途径标志物的蛋白质印迹法与 1-μs AMBER 分子动力学模拟和药代动力学分析相结合
章节片段
试剂和细胞系
小鼠乳腺癌细胞系 4T1 及其 HER2 表达变体 4T1-HER2 由 M. H. Kershaw 博士提供。4T1 细胞系是一种高转移性的人类 IV 期 TNBC 模型，其特征是不表达 ER、PR 和 HER2 (Mc Cart Reed et al., 2019; Venkitaraman, 2010)。4T1-HER2 细胞系保留了亲本 4T1 细胞系的基底样遗传背景，但经过工程改造以实现 HER2 的稳定过表达 (ER?/PR?/HER2+)，从而能够进行比较分析
体外研究结果
DEBIO 1143 的细胞毒性功效在 4T1 和 4T1-HER2 TNBC 模型中进行了评估，特别关注通过凋亡、自噬相关和 RIP3 相关非凋亡性细胞死亡标志物的分析来了解潜在的细胞死亡模式。表 2 提供了实验数据的综合总结，包括 IC?? 值、流式细胞术群体、MDC 染色结果和蛋白质印迹灰度分析。
讨论
在本研究中，我们提供了体外数据和长期计算机模拟的综合分析，以表征 DEBIO 1143 在三阴性乳腺癌中的治疗特性。体外研究发现表明，这种 SMAC 模拟物能够调节凋亡、自噬和类似坏死性凋亡的细胞死亡，特别是在初步蛋白质表达谱的背景下。这些实验观察结果进一步得到了微秒级分子动力学模拟的补充，提供了
结论
综上所述，本研究表明 DEBIO 1143 的 IC?? 剂量在 48?小时内对 TNBC 小鼠乳腺癌 4T1 和 4T1-HER2 细胞系发挥时间依赖性细胞毒性作用。在 48 小时时间点，两种细胞系的细胞毒性作用似乎主要通过非凋亡性细胞死亡机制进行。观察到的 cIAP1 减少与非凋亡性细胞死亡反应在时间上相关，并可能有助于下游 RIP3- 的激活和
未引用参考文献
(Biederbick et al., 1995, BIOVIA, 2021, Farahzadi et al., 2023, Farahzadi et al., 2024, Frisch et al., 2016, Jacquet et al., 2021, Jung et al., 2016, Lehtola et al., 2018, Lu and Chen, 2012, O'Boyle et al., 2011, Trott and Olson, 2010)
伦理声明
本研究未涉及人类参与者或实验动物。本研究中使用 4T1 和 4T1-HER2 细胞系是已建立的、商业来源的小鼠乳腺癌细胞系，其使用不需要特定的伦理批准。
CRediT 作者贡献声明
Erdal Balcan: 撰写 - 审查与编辑，可视化，方法学，形式分析。 Mehdi Irani: 撰写 - 审查与编辑，方法学，形式分析。 Meral Alp: 方法学。 Berrin TU?RUL: 撰写 - 原稿，资源，方法学，资金获取，概念化。
利益冲突
作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文中报告的工作。
致谢
本研究得到了马尼萨切拉尔巴亚大学科学研究项目委员会的支持 (项目编号：2019-006)。作者感谢马尼萨切拉尔巴亚大学科学研究项目委员会的财政支持。此处报告的部分数值计算是在 TUBITAK/ULAKBIM 高性能和网格计算中心 (TRUBA 资源) 完成的。
Berrin TU?RUL|Meral Alp|Mehdi Irani|Erdal Balcan
