菲律宾医蛭（Hirudinaria manillensis）抗血栓基因的异构体水平表征与结构多样性

《Toxicon: X》：Isoform-level characterization and structural diversity of antithrombotic genes in Hirudinaria manillensis

　　

摘要

药用蛭类的抗血栓蛋白最初是从唾液腺分泌物中表征的，可在摄食位点抑制凝血、血小板活化和纤维蛋白溶解，但可变转录加工对此类蛋白组库的贡献迄今仍缺乏系统记录。在本研究中，研究人员利用4个H. manillensis RNA-seq文库（THA-Hm1–THA-Hm4），其物种身份和整体测序性能已在配套研究中得到表征，以确定有多少抗血栓基因座能够产生多个结构上不同的转录本异构体，以及此类变异在多大程度上延伸至编码能力。参考引导组装合并为统一转录本集后，在72个已收录参考基因之外鉴定出38个受转录本支持的候选基因。将候选转录本按亲本MSTRG基因座分组并按异构体数量排序后，6个基因座携带3或4个结构上不同的模型：MSTRG.4545、MSTRG.5212、MSTRG.3310、MSTRG.5709、MSTRG.5200和MSTRG.5713。仅转录本长度变异就在6个基因座中的3个产生了异构体，而在MSTRG.5200、MSTRG.5709和MSTRG.5713，变异延伸至编码序列，产生了长度从49到1,159个氨基酸不等的预测蛋白。这些结果揭示了少数抗血栓基因座上的局部异构体复杂性，并为后续结构域注释、剪接连接可视化和功能验证界定了聚焦的候选集。

以下是根据论文主体内容撰写的学术解读文章：

**研究背景与意义**

药用蛭类通过唾液腺向宿主摄食位点分泌复杂的化学混合物，同时靶向凝血、血小板活化和纤维蛋白溶解过程，其活性成分包括直接凝血酶抑制剂、因子Xa抑制剂、激肽释放酶与弹性蛋白酶抑制剂、血小板聚集拮抗剂、纤溶激活因子以及透明质酸酶等组织穿透因子。在亚洲药用蛭类中，Liu等（2023）在修订的菲律宾医蛭（Hirudinaria manillensis）基因组组装中鉴定出分布在21个抗血栓基因家族中的72个抗血栓基因，使该物种成为该类群的基因组参考。尽管基因水平的目录已建立，但可变转录加工对抗血栓输出的贡献尚未被系统检验。可变剪接作为真核生物蛋白质多样性的主要产生机制，在脊椎动物中超过90%的多外显子基因产生多个转录本异构体，环节动物等无脊椎动物谱系也记录了相当比例的此类现象。对分泌型抑制剂蛋白而言，外显子组成差异可改变信号肽结构、反应位点环构型和二硫键模式，从而从单一基因组基因座产生结构和功能不同的肽段。蜱类唾液转录组已为此现象提供了明确实例，但蛭类抗血栓基因中相应的记录尚属空白。因此，本研究利用4个H. manillensis RNA-seq文库（THA-Hm1–THA-Hm4），旨在界定这些样本中表达的抗血栓组库、独立确认物种身份，并鉴定产生多个结构上不同转录本模型且具有抗血栓相似性的基因座。

**研究技术与方法**

研究人员从泰国东北部四省（廊开府、汶干府、乌隆他尼府和那空帕侬府）采集菲律宾医蛭标本，经7天饥饿处理清除消化道内宿主血液后，取整虫体制备RNA-seq文库，在Illumina HiSeq平台完成链特异性测序。COI条形码系统发育分析确认了物种身份。以Liu等（2023）公布的参考基因组和72基因抗血栓目录为框架，使用HISAT2进行参考引导比对，StringTie进行转录本组装与合并，GffCompare分配结构分类代码，BLASTn（E值阈值1×10??，最低核苷酸同一性40%）筛选抗血栓样候选转录本，并利用自定义Python脚本预测最长开放阅读框（ORF），MAFFT进行蛋白质多序列比对。基因表达谱通过featureCounts定量和PCA分析表征，样本为独立生物学个体而非重复样本。

**研究结果**

**3.1 样本鉴定：** 所有4个RNA-seq文库均通过细胞色素c氧化酶亚基I（COI）条形码鉴定为Hirudinaria manillensis，仅来自确认标本的文库被纳入后续异构体水平分析。

**3.2 个体间转录组变异：** 主成分分析（PCA）显示，PC1（43.6%）和PC2（29.8%）共同解释73.4%的总方差，4个文库在二维空间中占据完全不同的位置，无任何两个文库聚集在一起，表明这些独立生物学样本之间存在显著的转录组个体差异。

**3.3 参考抗血栓目录涵盖72个基因和18个功能家族：** 所有72个已知抗血栓基因在至少一个文库中可检测。加入异构体匹配和重叠匹配记录后，转录本条目总数达110个。HMEI家族条目最多（34条，含16条额外记录），hirustasin次之（19条，含6条额外记录），destabilase贡献6条，haemadin/hirudin、apyrase和hyaluronidase各5条。LDTI、LCI和therostasin均仅由单一参考基因代表。7条序列无法明确归属，归入“其他”类。

**3.4 抗血栓基因表达在个体间存在差异：** 4个文库均通过质量控制和比对率阈值，无文库因低质量或比对失败被排除。72个参考基因的片段计数显示基因间和文库间的显著变异：lefaxin基因表达最强，多个HMEI旁系同源基因表现出文库偏向性表达，hirudin_Hman1在THA-Hm4中相对表达最高，progranulin在THA-Hm1中显著富集，GGT在THA-Hm2中特异性升高。由于缺乏受控的摄食、年龄和性别元数据，这些差异应视为独立样本间生物学异质性的描述性观察，而非特定因果因素的证据。

**3.5 转录本发现新增38条抗血栓样候选记录：** StringTie重构结合GffCompare分类和BLASTn筛选，在72个参考基因之外恢复了38条额外的抗血栓样转录本记录。其中30条为class-code j（与参考基因座共享至少一个剪接连接），5条为class-code o（外显子重叠但无共享连接），3条为class-code x（反义链重叠）。无class-code u转录本通过筛选，表明转录复杂性集中在既有抗血栓基因座附近。HMEI相关基因座占额外记录的16条，hirustasin相关6条，bdellin和destabilase各3条。

**3.6 六个候选基因座携带结构上不同的转录本模型：** 按亲本MSTRG基因座分组并按异构体数量排序后，6个基因座——MSTRG.4545、MSTRG.5713、MSTRG.3310、MSTRG.5709、MSTRG.5212和MSTRG.5200——各携带3或4个结构上不同的转录本模型。结构比较揭示了两种不同的异构体变异模式：在MSTRG.3310（hirustasin，4个转录本，5,491–5,997 bp，预测蛋白均为331 aa）、MSTRG.4545（4个转录本，3,711–7,183 bp，预测蛋白均为71 aa）和MSTRG.5212（bdellin，3个转录本，4,510–4,533 bp，预测蛋白均为121 aa），转录本长度差异落在注释编码序列之外，未改变预测蛋白产物。而在MSTRG.5200（482–3,703 bp，预测蛋白49–106 aa）、MSTRG.5709（967–12,801 bp，预测蛋白98–201 aa）和MSTRG.5713（1,132–23,635 bp，预测蛋白100–1,159 aa），异构体变异延伸至编码序列，产生不同长度的预测蛋白。MSTRG.5713最长的1,159 aa预测蛋白远超典型的分泌型HMEI抑制剂肽段，提示可能编码多结构域前体蛋白。

**3.7 候选异构体的转录本长度与编码潜力：** 散点图显示HMEI相关候选（蓝点）跨越从<500 bp到>22,000 bp的广泛范围，预测蛋白49–1,159 aa；hirustasin（绿点）聚集在5,500–6,000 bp附近，预测蛋白统一为331 aa；bdellin（红点）占据约4,500 bp的狭窄窗口，预测蛋白121 aa。MSTRG.5212异构体携带6–7个外显子，为数据集最高，而许多紧凑型HMEI异构体仅含2–3个外显子。MSTRG.5713大型转录本与较高外显子数的组合，提示较长异构体中包含额外的内部外显子而非简单的UTR延伸。

**讨论与结论**

多转录本抗血栓基因座呈集中而非均匀分布：38个转录本支持候选中的6个亲本MSTRG基因座各携带3或4个不同模型，HMEI和hirustasin相关信号主导发现集。MSTRG.5713最长的预测ORF（1,159 aa）远大于典型成熟HMEI肽段（通常<200 aa），提示可能存在多结构域前体结构，该解释需质谱检测、信号肽预测和结构域建模验证。COI分析的重要发现是4个样本的一致序列完全相同，与参考序列MN882685的同一性为99.842%，低于hirudinid蛭类种内COI变异的典型阈值（2%），系统发育定位明确将研究序列置于H. manillensis参考支系内。PCA中4个文库的显著分离与相同COI单倍型形成对比，表明转录组个体性在抗血栓基因表达中的作用远超单个线粒体条形码位点的分辨率。本研究的局限包括短读长组装可能产生不完整或嵌合转录本模型、参考基因集未纳入2023年后报道的decorsin家族和弹性蛋白酶抑制剂家族，以及样本量仅4个且缺乏实验分组。尽管如此，6个优先候选基因座（尤其是MSTRG.5713、MSTRG.5709和MSTRG.3310）代表了编码长度变异大、外显子密度高且与功能表征的抗血栓基因家族同源性强的关键靶点。未来工作应扩大文库数量以进行事件水平剪接分析，结合组织分辨蛋白质组学和重组表达将候选目录转化为实验验证的功能变体。本研究建立了H. manillensis抗血栓基因的结构异构体目录，为下游结构域注释、剪接连接可视化和功能验证界定了聚焦的候选集。该论文发表于《Toxicon: X》。