《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Towards point-of-care diagnostics of neglected tropical diseases using nucleic acid amplification tests
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被忽视热带病（NTDs）给全球带来了沉重的负担，然而，历史上针对这些疾病的诊断创新一直低于其他主要传染病。弥补这一诊断空白是其被消除的先决条件，世界卫生组织（WHO）也对此予以认可。本综述通过对39项研究的系统分析，评估了当前床旁核酸扩增检测（POC NAAT
被忽视热带病（NTDs）给全球带来了沉重的负担，然而，历史上针对这些疾病的诊断创新一直低于其他主要传染病。弥补这一诊断空白是其被消除的先决条件，世界卫生组织（WHO）也对此予以认可。本综述通过对39项研究的系统分析，评估了当前床旁核酸扩增检测（POC NAATs）的应用范围。这一评估通过分解核酸扩增工作流程及其相关的实施障碍来实现，重点关注操作可行性，而非诸如敏感性和特异性之类的分析指标。所审阅的文献显示了一些反复出现的主题，例如简化的提取方法、平台或设备上的集成工作流程、用于结果判读的智能手机应用程序、减少冷链依赖以及无需电力即可操作的工作流程。然而，研究也发现了若干技术、分析和实施方面的障碍，这些障碍阻碍了从概念验证原型向符合WHO对POC检测标准要求的、可现场部署工具的转化。本综述表明，目前针对NTDs的大多数NAAT开发成果尚未完全满足WHO在资源有限环境中进行POC应用的标准。尽管存在改进的机会以及将NAAT平台重新应用于其他疾病的可能性，但为实现WHO设定的目标，仍需仔细审视从样本采集到现场成熟实施的每一个步骤。
引言
被忽视热带病（NTDs）是一组多样化的寄生虫病、细菌病和病毒性疾病，对健康和经济造成严重影响，主要影响脆弱、边缘化的人群。由于其许多疾病是媒介传播或具有动物储存宿主，且生命周期复杂，使得公共卫生控制本身就非常复杂，并干预困难。因此，在缺乏清洁水、卫生设施和医疗服务的地区，这些疾病得以盛行。这反过来可能导致贫困的恶性循环，其特征是教育、职业前景不佳以及污名化和社会排斥。历史上，这些疾病被认为影响了149个国家的生活质量，但尽管如此，与疟疾等疾病相比，它们在全球卫生议程和资金方面获得的关注却不成比例地低，尽管NTDs代表了巨大的疾病负担。目前，这些疾病影响超过10亿人，每年导致超过10万例死亡，并且由于缺乏及时治疗，尽管许多NTDs是可治疗的，仍有数亿人严重残疾或丧失能力。
过去十年中，在控制和消除这些疾病方面取得了进展，伤残调整生命年从2015年的1700万减少到2021年的1400万，需要干预的人数从2015年的18亿下降到2023年的15亿。然而，受影响个体的数量仍然很高，并且某些地区患病率的下降使得以前的解决方案日益不适用。此外，诸如疾病认识不足、就医行为延迟、人口迁移、气候变化和抗菌素耐药性等挑战仍然存在并加剧了问题。
为了解决这个问题，世界卫生组织（WHO）已将诊断创新确定为优先领域。作为基础性步骤，诊断测试对医疗决策有重大影响，但其开发尚未获得足够的资金。因此，尝试使用其他策略来控制NTDs，例如大规模给药（MDA）。
被忽视热带病的传统诊断方法
被忽视热带病的传统诊断方法在可负担性与可靠诊断测试所需的准确性、敏感性和特异性之间存在权衡。这些方法包括显微镜检查、血清学、分子和培养检测以及临床表现。虽然每种方法都有其优势，但其固有的缺点使其不足以用于低收入和中等收入国家的NTD诊断。由于控制这些疾病所取得的进展导致了较低的感染负荷，这使得低灵敏度的检测方法不再适用。此外，这些测试在不同程度上需要专业人员和设备，这在资源有限环境中、对诊断测试需求很高的分散式医疗诊所实施起来具有挑战性。由于WHO的优先目标是新的诊断测试具有可及性，因此在床旁（POC）的适用性成为一个关键标准。
已确定的诊断需求
每种NTD都有WHO定义的疾病特异性优先事项，其中包括为根除、阻断传播、作为公共卫生问题消除或疾病控制提供有效且可负担的诊断方法。根据WHO 2025年全球报告，在目前确认的26种NTD中，没有一种拥有有助于实现既定目标的现有诊断测试。此外，约31%的这些疾病被标记为需要采取关键行动以实现2030年的目标。为了帮助开发具有所需特性的诊断测试，WHO为包括布如里溃疡、人类非洲锥虫病、麻风病、利什曼病、淋巴丝虫病、足菌肿、盘尾丝虫病、疥疮、血吸虫病、土壤传播蠕虫病、沙眼和雅司病等疾病设定了目标产品特性（TPPs）。虽然这些TPPs在样本类型、物种区分和目标人群等参数上有所不同，但整个群体中显示出几个共同的技术要求。这些测试面临的挑战在于，在分散的环境中实现高敏感性和特异性，同时通过创新方法减轻诸如电力受限和用水受限等操作性限制。
床旁诊断测试
为了实现WHO描述的ASSURED标准（可负担、敏感、特异、用户友好、快速且稳健、无需设备、可交付给最终用户）的理想POC诊断测试特性，研究正在增加。考虑到标准实施以来的经验教训和技术进步，已提出在更新后的REASSURED标准中增加实时连接性、样本采集便利性和环境友好性等因素。遵循REASSURED标准的POC诊断不仅对患者，而且对操作员、医生、卫生服务和整个社区都显示出优势和益处。这些优势源于无需将样本运送到实验室进行集中检测并等待结果，因为通过POC测试进行的诊断可以在单次临床接触中完成，这增加了及时干预的机会。
核酸扩增检测
与传统的检测方法类似，POC测试有不同的靶标和选择，各有其优缺点。其中，核酸扩增检测（NAATs）因其高特异性和高敏感性而脱颖而出。这在低流行地区尤为重要，因为许多其他POC测试无法检测到低感染负荷。以前，NAATs仅限于拥有专门设备和训练有素人员的实验室，但扩增检测的进展使其也能在资源有限的环境中执行。然而，由于相对复杂的工作流程，将这些测试转移到POC需要进行调整。因此，为了获得符合ASSURED标准的POC测试，需要考虑从样本采集到检测的样本到答案工作流程中的所有步骤。展示POC设置测试的出版物主要关注扩增和检测的最后步骤，产生了具有巨大潜力的高灵敏度和特异性检测方法。然而，诸如严格样本制备的要求、结果判读和报告的实用性以及防止交叉污染的保障措施等障碍尚未得到深入讨论。正是由于这些被忽视的方面以及历史上的疏忽，目前只有少数NAATs符合针对NTDs的ASSURED标准。
当前范围与局限性
基于已识别的差距，目前用于NTDs的POC NAATs范围仍然受限。来自创新诊断基金会测试目录的数据强调了这一点，仅列出了17种能够在POC或接近POC实施的检测方法。Scopus数据显示NTD相关文章呈逐年增加趋势，其中约25%涉及这些疾病的诊断。在此子集中，NAATs不如免疫学方法常见。当筛选POC适用性时，年产出仅占所有NTD诊断文章的约2%。这凸显了针对NTDs的POC NAATs研究存在不足。尽管POC NAATs总体研究在COVID-19大流行期间迅速增加，但这一趋势并未在NTDs上得到强烈体现。
样本类型
旨在开发适用于资源有限环境POC诊断测试的出版物，大多只针对NAAT工作流程的一部分。对于POC测试，样本最好是微创且易于采集的，如唾液、尿液、拭子或指尖毛细血管血。根据疾病的不同，这可能会受到限制，因为可收集的靶标量部分取决于感染性靶标的样本类型。转换为无创样本可能会降低测试的敏感性，尤其是没有浓缩步骤时。不同样本也会因其基质不同和存在干扰物而带来各自的生物化学挑战。环境变量如环境温度和湿度也是影响样本稳定性及检测性能的关键因素。
样本制备
样本采集后，工作流程中最需要动手操作的部分是样本制备，包括从细胞裂解到核酸纯化和浓缩的步骤。传统上，这使用市售试剂盒完成，但这些试剂盒推高了检测成本，且通常需要离心机等仪器。一些替代方法已被提出，从直接粗样本添加到简化裂解和纯化。使用粗样本可减少出结果时间、手动操作步骤和检测成本，但也存在挑战，主要是抑制剂的存在。PCR比等温方法如环介导等温扩增（LAMP）或重组酶聚合酶扩增（RPA）更容易受到抑制。除了使用粗样本，也有不需要试剂盒的简化方案，大致可分为热裂解、无仪器以及集成和纸基提取三类。许多审阅的文章中，样本制备方面仍未得到充分重视，而重点则放在了用户友好的扩增和检测上。
核酸扩增与试剂稳定性
在相关出版物中描述的扩增方法，无论是金标准PCR还是广泛应用的等温方法之一，都被描述为适用于分散式检测。PCR传统上限于实验室，但便携式热循环仪的出现使其可用于POC测试。等温扩增也需要热源，但由于其恒温操作，不需要复杂设备。除了简单的加热板设置，还有无需电力的工作流程示例。即使有可用简单仪器进行的扩增方法，一个常被引用的在资源有限环境中应用的障碍是试剂的冷链依赖。为限制这种影响，一些出版物使用了冻干试剂或冻干方案。尽管克服了冷链障碍，但环境因素和保质期等困难仍然存在，这显示了现场验证的重要性。
检测策略
生物分析工作流程的最后一步——检测，有几种替代方案，从低成本、无需仪器的定性读出到高灵敏度、仪器依赖的定量检测。在审阅的文章中，最常用的检测方法是荧光检测。
