PFKM作为代谢开关启动甜甜圈状线粒体重塑以促进成骨分化

《International Journal of Oral Science》：PFKM acts as a metabolic switch initiating donut-shaped mitochondrial remodeling to promote osteogenesis

　　

成骨分化需要复杂的线粒体适应性以满足生物能量需求，然而调控该细胞器重组的检查点仍不明确。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）再分析与代谢干预，研究人员揭示了传统上仅被视为糖酵解酶的PFKM在骨形成过程中协调线粒体重塑的非经典信号作用。除已确立的代谢功能外，Pfkm抑制通过一条新型信号级联触发独特的甜甜圈状线粒体。机制上，Pfkm敲低扩张线粒体-内质网接触位点（MERCs），促进线粒体钙内流；同时CD38升高抑制蛋白激酶A（PKA）活性，诱导DRP1在丝氨酸656（Ser656）去磷酸化。该信号整合促进DRP1线粒体转位，驱动特征性甜甜圈架构。此结构转化启动全面线粒体质量调控（MQC），涵盖增强的生物发生、选择性线粒体自噬（mitophagy）及线粒体衍生囊泡（MDVs）分泌，共同优化成骨微环境与细胞矿化能力。体内验证显示AAV介导的Pfkm敲低加速大鼠颅骨与股骨缺损模型骨修复。本研究确立PFKM为桥接代谢与线粒体信号的双功能调控因子，为骨再生提供有效治疗途径。

研究背景与立项依据：骨髓间充质干细胞（BMSCs，bone marrow-derived mesenchymal stem cells）向成骨细胞谱系分化伴随从糖酵解向氧化磷酸化（OXPHOS）的代谢重编程，该转变提升生物能量供给但同时增加线粒体活性氧（mtROS）负荷，需依赖线粒体质量调控（MQC，mitochondrial quality control）系统维持稳态。目前上游感知代谢偏移并耦联线粒体结构重组的检查点未知，PFK（磷酸果糖激酶）家族尤其是肌肉型PFKM在成骨中是否超越经典糖酵解酶发挥信号节点作用尚未阐明。研究人员整合小鼠骨折愈合scRNA-seq再分析、体外大鼠BMSCs（rBMSCs）功能筛选与大鼠颅骨/股骨临界缺损模型，证实Pfkm敲低作为代谢检查点启动ERK/c-Jun-CD38轴→MERCs扩张→钙内流→PKA抑制→DRP1 Ser⁶⁵⁶去磷酸化→甜甜圈状线粒体→MQC全面激活→成骨加速的级联，成果发表于《International Journal of Oral Science》。

主要关键技术方法：研究基于小鼠骨折与对照骨组织公开scRNA-seq数据集做UMAP降维、Monocle3伪时间轨迹与ssGSEA通路评分；体外以大鼠BMSCs为样本，用SiRNA敲低Pfkm/Pfkl/Pfkp，Seahorse XF测OCR（氧耗率）与PER（质子外排率），MitoTracker/Sim结构光显微镜/TEM表征线粒体形态，Rhod-2 AM测线粒体钙，Western blot检测p-DRP1 Ser⁶⁵⁶、PKA、CD38、LC3B-II、TOMM20、PGC-1α等；通过DRP1-S656D磷酸模拟突变、MCU-i4、CD38抑制剂1、SCH772984、forskolin等反向验证；分离条件培养基中Mito/MDVs做共培养递送实验；体内采用AAV-shPfkm局部转导大鼠颅骨与股骨临界缺损模型，Micro-CT、钙黄绿素双标动态组织形态计量及H&E/Masson/OPN免疫荧光评估。

研究结果：

代谢重编程与PFKM作为检查点：scRNA-seq显示成骨谱系沿伪时间糖酵解尤其Pfk家族下调、OXPHOS上升；体外寡霉素A阻断OXPHOS或2-DG阻断糖酵解均抑成骨，而SiPfkm特异性促ALP/ARS阳性、升OCR、降PER，并部分 Rescue 上述抑制，确立PFKM为成骨代谢“刹车”与开关。

Pfkm敲低启动甜甜圈状线粒体：MitoTracker/SIM/TEM证实Day3–7出现碎片化伴腔嵴减少的甜甜圈状线粒体，膜电位稳定、mtROS下降、Ucp2上调；常规裂变剂BC1618/MYLS22仅碎片化不复制成骨表型，说明形态特异。

甜甜圈状架构驱动MQC：mtDNA拷贝数与PGC-1α升，LC3B-II升、TOMM20/p62降，TEM见自噬体包裹线粒体，LC3B-线粒体共定位增；Mdivi-1或3-MA阻断裂变/线粒体自噬后成骨回落；条件培养基析出0.5–5 μm颗粒及70–100 nm MDVs，COX IV/TOMM20富集，GFP-Mito/MDVs被受体rBMSCs内化并提升其成骨能力。

DRP1 Ser⁶⁵⁶去磷酸化机制：总DRP1不变，p-DRP1 Ser⁶⁵⁶特异降（Ser⁶³⁵不受影响），DRP1转位线粒体增；S656D突变阻断甜甜圈形成、MDVs分泌与成骨增益；Pfkm敲低降PKA活性，forskolin回升p-DRP1 Ser⁶⁵⁶，证Pfkm→PKA↓→DRP1去磷酸化。

MERCs-Ca²⁺轴：RNA-seq示Cd38显著升，KEGG/GSEA富集聚钙信号；SIM/TEM示MERCs频率与界面贴近度增，Ip3r1/Ryr1/Mcu/Micu1/Vdac1/Esyt1/Grp75/Pacs2转录升；Rhod-2 AM示Day1线粒体Ca²⁺峰最高；CD38抑制剂1或MCU-i4回补p-DRP1 Ser⁶⁵⁶、复原网状线粒体并抑成骨。

ERK/c-Jun转录上调CD38：JASPAR预测Cd38启动子AP-1位点保守，Pfkm敲低升p-ERK1/2与p-c-Jun；SCH772984抑p-c-Jun/CD38/PDE1A/p-DRP1，复原网状线粒体、抑线粒体自噬、降ALP/ARS。

体内骨再生：AAV-shPfkm（2×10¹¹ vg）经皮下（颅骨）或髓内（股骨）预转导，术后4周（颅骨）或2周（股骨）Micro-CT示BV/TV、BMD、Tb.Th、Tb.N提升，钙黄绿素标记MAR/BFR/BS/MS/BS增高，H&E/Masson/OPN示胶原有序沉积与新骨标志物强表达。

讨论与结论翻译：未分化MSC倚重糖酵解，谱系定型需转向OXPHOS并启动MQC防氧化损伤。本研究填补上游传感器空白，将PFKM定为代谢-线粒体重塑主控：其抑制激活ERK/c-Jun/CD38→MERCs扩张与钙内流→PKA抑→DRP1 Ser⁶⁵⁶去磷酸化→甜甜圈状线粒体作为平台促生物发生、选择性线粒体自噬与Mito/MDVs释放，优化生物能量适能而驱成骨。甜甜圈态非凋亡前兆，具高比表面、抗自噬清除、保膜电位，伴mtDNA快速复制而核编码膜蛋白滞后，解释mtDNA升/TOMM20降并存；其缺典型嵴近似高OXPHOS亚群。MDVs与线粒体自噬分层质控，Ucp2轻度解耦抑mtROS，使高OXPHOS不伴氧化应激。MERCs由IP3R-GRP75-VDAC等锚定，Pfkm敲低升Ip3r1反馈促接触位点组装。PFKM因而兼行经典代谢酶与非经典信号“moonlighting”功能。结论：PFKM是桥接代谢重编程与线粒体信号的结构性节点，靶向Pfkm经AAV在颅/股缺损加速骨修复，为骨再生提供可转化代谢-线粒体干预新轴。