《Antioxidants》：Structural and Antioxidant Comparison Between Native WPI and WPI-Resveratrol Non-Covalent Complex
编辑推荐：
人口老龄化使肌少症(sarcopenia)成为老年健康日益关注的问题。蛋白质-多酚非共价复合物可作为载体系统，提高天然抗氧化剂的稳定性和生物活性。本研究优化了乳清分离蛋白(whey protein isolate, WPI)与白藜芦醇(resveratrol,
人口老龄化使肌少症(sarcopenia)成为老年健康日益关注的问题。蛋白质-多酚非共价复合物可作为载体系统，提高天然抗氧化剂的稳定性和生物活性。本研究优化了乳清分离蛋白(whey protein isolate, WPI)与白藜芦醇(resveratrol, RES)非共价复合物的制备参数，在pH 7.0、WPI:RES摩尔比1:1、反应时间1.5 h条件下，实现蛋白质消化率83.60 ± 0.50%和DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)清除率52.41 ± 0.58%。相对于游离WPI，该复合物DPPH清除率提高21.66%，同时保持蛋白质消化率。通过光谱实验、分子对接(docking)和分子动力学模拟(molecular dynamics, MD)研究了结合模式、相互作用力及构象演变。RES通过疏水相互作用和氢键选择性结合WPI中β-乳球蛋白(β-lactoglobulin, β-Lg)表面，对接评分为-6.366 kcal/mol，MM-GBSA结合自由能为-30.48 kcal/mol。在100 ns分子动力学模拟中，复合物保持高度稳定的构象。总之，本研究阐明了WPI非共价结合RES后的结构变化。WPI-RES复合物在保持蛋白质消化率的同时表现出增强的DPPH自由基清除活性，对肌少症管理中的功能性食品开发具有潜在意义。
人口老龄化背景下，肌少症已成为老年健康的重要威胁，其以肌肉质量、力量和功能丧失为特征，与肌肉蛋白失衡、线粒体功能障碍及氧化应激密切相关。膳食中的蛋白质和多酚可通过调节肌肉代谢、减轻炎症来缓解肌少症。乳清分离蛋白(whey protein isolate, WPI)因高消化率和富含支链氨基酸被广泛用于特殊膳食产品，但加工中易变性聚集，影响其功能。白藜芦醇(resveratrol, RES)作为植物来源多酚，具有强抗氧化和抗炎活性。蛋白质-多酚非共价复合物可协同增强二者功能，但现有研究多集中于复合物自身性质，对复合态与未修饰蛋白的直接比较，尤其是分子水平的比较仍然有限。为此，研究人员以WPI和RES构建非共价复合物，优化制备条件以获得兼具良好抗氧化活性和消化率的产品，并通过多光谱技术与分子模拟系统比较游离WPI与WPI-RES复合物的结构和功能差异，为其在肌少症营养干预中的应用提供依据。该研究成果发表于《Antioxidants》。
研究人员采用单因素实验结合L9(3?)正交试验，以DPPH自由基清除率和体外蛋白质消化率为评价指标，优化制备条件。表征手段包括紫外-可见吸收光谱、内源荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、表面疏水性测定及扫描电子显微镜(SEM)观察微观结构。分子层面采用分子对接(molecular docking)和100 ns分子动力学模拟(molecular dynamics, MD)分析结合模式、相互作用力及构象稳定性。氨基酸组成按国家标准GB 5009.124-2016测定。所有实验均设三次重复，数据经SPSS 27.0进行统计分析。
在制备条件优化中，通过单因素实验考察反应时间、pH和摩尔比的影响。结果表明，pH对复合物综合性能影响最显著，最佳参数为pH 7.0、WPI:RES摩尔比1:1、反应时间1.5 h。该条件下，WPI-RES复合物DPPH清除率达52.41 ± 0.58%，蛋白质消化率83.60 ± 0.50%，较游离WPI的DPPH清除率提高21.66%，而蛋白质消化率无显著差异，说明RES结合增强了抗氧化活性且不损害蛋白质消化率。
氨基酸组成分析显示，WPI和WPI-RES复合物的必需氨基酸占总氨基酸比例分别为41.5%和38.9%，符合FAO/WHO(2007)理想蛋白模式；支链氨基酸占比21.4%和18.6%，疏水性氨基酸占37.6%和35.4%，甘氨酸占1.8%和1.7%。复合物氨基酸绝对含量降低，可能因非共价结合遮蔽了蛋白酶作用位点，但整体氨基酸谱仍保持营养平衡。
紫外-可见吸收光谱中，WPI-RES复合物相较WPI出现蓝移和减色效应，说明RES插入WPI疏水腔，包裹原本暴露的芳香族氨基酸残基，限制电子跃迁，降低生色团微环境极性。
内源荧光光谱显示，相同浓度下复合物荧光强度明显猝灭，并出现1~3 nm红移。RES结合在色氨酸残基附近，轻微增加局部极性，但未破坏蛋白整体疏水核心。
同步荧光光谱中，Δλ=15 nm时，复合物酪氨酸残基荧光显著降低且蓝移1~11 nm，表明RES通过疏水相互作用与酪氨酸结合，降低其微环境极性；Δλ=60 nm时仅低浓度组出现明显蓝移，色氨酸区域对RES结合高度敏感。RES通过多位点同时影响酪氨酸和色氨酸微环境，使蛋白构象从紧密趋于松散。
三维荧光光谱显示复合物两个特征峰强度显著降低，峰1（色氨酸和酪氨酸残基）猝灭率达59.35%，并伴10 nm红移；峰2（多肽骨架）猝灭率52.72%，无明显位移。芳香族残基是RES核心结合位点，结合作用深入蛋白内部，引发全局构象变化。
FTIR分析中，复合物的酰胺I带和酰胺II带发生位移，归因于多肽C=O微环境改变及RES酚羟基与蛋白氨基间氢键作用。饱和C-H区和O-H/N-H区峰形变化证实疏水相互作用和分子间氢键网络形成。二级结构定量显示，低浓度RES增加β-折叠含量；高浓度RES显著增加α-螺旋含量，减少无规卷曲和β-转角，使蛋白结构更有序、刚性更强。
表面疏水性测定中，WPI-RES复合物表面疏水性显著低于WPI，RES优先结合溶剂暴露的疏水残基，并诱导蛋白构象重排，使疏水残基重新埋入蛋白核心。
SEM观察显示，天然WPI呈连续致密片状聚集体，复合物转变为疏松多孔的碎片状形貌，表面附着针状微晶，比表面积增大，有利于提高RES包埋稳定性和蛋白分散性。
分子对接结果显示，RES结合于WPI中β-Lg表面，对接评分为-6.366 kcal/mol，低于强结合阈值，表明结合稳定。RES与ASN109和PRO38形成氢键，并与周围氨基酸存在疏水作用，疏水相互作用占主导。
100 ns分子动力学模拟中，蛋白骨架RMSD在20 ns后稳定于1.5~2.4 ?，配体RMSD保持在0.6 ?左右，表明复合物构象稳定。RMSF显示蛋白柔性区域主要位于84–90和106–116残基段，配体RMSF始终低于1.2 ?。回转半径(Rg)在14.7–15.1 ?范围内小幅度波动，复合物整体紧凑。溶剂可及表面积(SASA)和极性表面积(PSA)在模拟后期保持稳定，进一步证实结构稳定。模拟轨迹分析表明，疏水作用贯穿全程，ILE12和ALA16等残基参与疏水接触，GLU45与水桥氢键相关，ARG124形成π-阳离子相互作用，MM-GBSA结合自由能为-30.48 kcal/mol，确认自发稳定结合。二级结构分析显示β-折叠和α-螺旋为主要结构，仅在80–90残基区域发生局部β-折叠向α-螺旋转变，未出现整体去折叠。
综合而言，该研究揭示了RES非共价结合WPI后诱导的结构变化：RES主要通过疏水作用和氢键锚定β-Lg，使蛋白二级结构更有序，表面疏水性降低，微观结构由致密片状变为疏松多孔，从而增强复合物抗氧化能力，同时保持蛋白质消化率。100 ns分子动力学模拟证实复合物具有高构象稳定性。这些发现表明WPI-RES复合物可作为肌少症管理的潜在功能性食品成分，但仍需进一步的细胞和体内研究以转化为实际营养干预策略。
