《Antioxidants》：Metabolic Dysregulation and Oxidative Stress in Diabetic Retinopathy: Glycogen Metabolism, Mitochondrial Dysfunction, and Antioxidant Defences
编辑推荐：
糖尿病视网膜病变（DR）是可预防性视力损害的主要原因，其发生发展涉及代谢、氧化、炎症和神经血管紊乱的交织作用。本综述探讨了慢性高血糖如何破坏视网膜葡萄糖处理和氧化还原稳态，特别强调糖原代谢作为疾病进展中一个未被充分认识的贡献因素。视网膜无长突细胞和视网膜色素上
糖尿病视网膜病变（DR）是可预防性视力损害的主要原因，其发生发展涉及代谢、氧化、炎症和神经血管紊乱的交织作用。本综述探讨了慢性高血糖如何破坏视网膜葡萄糖处理和氧化还原稳态，特别强调糖原代谢作为疾病进展中一个未被充分认识的贡献因素。视网膜无长突细胞和视网膜色素上皮细胞中的病理性糖原积累可能源于糖原合酶定位改变和葡萄糖-6-磷酸依赖性激活，这有可能干扰细胞内转运和细胞能量平衡。这些代谢变化与线粒体电子传递链功能障碍、NADPH氧化酶激活、多元醇通路通量以及光驱动的脂质过氧化共同作用，增加了活性氧（ROS）的产生。与此同时，Nrf2依赖性抗氧化防御的短暂抑制、TXNIP-NLRP3炎症小体信号传导、铁死亡损伤以及VEGF相关的氧化反馈促进了血-视网膜屏障破坏和持续性神经炎症。研究人员提出，失调的糖原代谢和受损的抗氧化能力形成了一个整合的代谢-氧化还原网络，这有助于解释DR中细胞特异性易感性和代谢记忆。针对该网络中的多个节点进行干预，可能支持超越晚期血管并发症治疗的更早期的疾病修饰策略。
1. 引言
糖尿病视网膜病变（DR）是全球劳动年龄成年人中可预防视力损害的首要原因，影响超过1亿人，其中超过2800万人存在威胁视力的并发症。DR源于慢性高血糖对视网膜神经组织和微血管的损伤，涉及多元醇通路通量增加、晚期糖基化终末产物（AGEs）生成增多、蛋白激酶C亚型激活以及己糖胺通路活性增强等四种主要致病机制。这些通路汇聚，产生氧化应激、炎症介质释放和线粒体功能障碍，破坏视网膜精密的神经血管单元。DR进展经历不同临床阶段，增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）以视盘或视网膜其他部位病理性新生血管形成为特征，常见并发症包括玻璃体出血、牵拉性视网膜脱离和新生血管性青光眼。糖尿病黄斑水肿可发生于任何临床阶段，与增殖性疾病共同构成本病严重视力损害的主要原因。视网膜神经感觉层由不同层状结构组成，各层细胞具有特定的代谢需求和不同程度的高血糖损伤易感性。一般而言，耗氧率越高，对氧化损伤的易感性越强，如外核层光感受器具有人体最高的耗氧率之一。无长突细胞通过情境性、交叉性和任务特异性回路塑造神经节细胞输出，并被认为通过无长突-视杆双极细胞突触参与视网膜电图（ERG）振荡电位（OP）的产生。在糖尿病中，OP振幅在视网膜病变临床可见之前即下降，与毛细血管丛变化相关，但其代谢处理方式仍未得到充分研究。免疫组织化学分析显示，实验性啮齿动物模型中糖尿病无长突细胞异常积聚浓缩糖原沉积物，但其精确代谢作用和易感模式尚不清楚。
健康的视网膜葡萄糖代谢受到严格调控以满足组织极端能量需求。葡萄糖主要通过GLUT1（RPE和血管内皮）和GLUT3（主要为神经元）转运体进入视网膜细胞，在正常有氧条件下，大部分ATP通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生。较小部分的葡萄糖进入磷酸戊糖途径产生NADPH，或以糖原形式储存以供后续能量动员。糖原磷酸化酶（GP）是分解糖原的酶，存在脑（b）、肌（m）和肝（l）三种亚型。糖原合酶（GS）是糖原合成中的限速酶，受磷酸化抑制转化为磷酸化糖原合酶（pGS）。在人类视网膜色素上皮（RPE）细胞中，发现肌型而非肝型GS亚型。在正常代谢条件下，视网膜神经元（大鼠无长突细胞和神经节细胞）中的GS主要被隔离在细胞核内，因其磷酸化状态以及核定位序列与葡萄糖-6-磷酸激活位点重叠，限制了变构激活。因此，在健康视网膜中，GS很可能被隔离在细胞核中，导致低胞质活性，作为限制神经元中异常糖原积累的安全机制。在糖尿病等神经元病理状态中，高血糖与糖原合酶从细胞核向细胞质的重新分布相关，葡萄糖-6-磷酸被认为是这种重新定位的介质。
2. 糖尿病视网膜中的糖原
2.1. 糖尿病中视网膜神经元的异常糖原储存
在链脲佐菌素诱导的糖尿病Sprague–Dawley大鼠（链脲佐菌素65 mg/kg，持续终末期血糖25.5 ± 5.4 mM）中观察到视网膜无长突细胞特异性的异常改变。对照视网膜无长突细胞显示稀疏、离散的β-颗粒糖原颗粒（约30 nm）。糖尿病无长突细胞胞质中观察到pGS积累。pGS从细胞核向细胞质的重新定位与胞质糖原合成增加相关，导致无长突细胞内病理性糖原储存。然而，当外血-视网膜屏障的转运机制被破坏时，神经视网膜对精确调控葡萄糖通量的深度依赖同样明显。RPE中GLUT1的靶向基因缺失急剧减少视网膜葡萄糖可用性，引发显著代谢应激，导致视杆光感受器结构变性和死亡，同时伴随Müller胶质细胞的应激诱导激活。
在高血糖条件下，内层视网膜细胞（无长突细胞（INL）和神经节细胞（GCL））中过量葡萄糖通过糖原代谢的处理被破坏。对照神经节细胞和无长突细胞中发现强GP免疫染色，具有明确的内丛状层分层。对照组中pGS主要定位于视网膜神经元细胞核，血管和视杆细胞中缺失。在糖尿病视网膜中，糖原充盈的无长突细胞平均为26个细胞/mm（SD约5，范围18–33个细胞/mm），而对照组为0.5个细胞/mm（SD约0.2）（p < 0.0001）。在DR组中，许多无长突神经元胞质中观察到大的核周糖原积累。此外，内丛状突起和膨胀的无长突细胞体中GP表达增加，提示致病性视网膜条件下葡萄糖释放上调。72%的糖尿病INL细胞显示pGS核染色减少或缺失，而对照组为0.52%（p < 0.0001），与酶的去磷酸化和胞质转位一致。由于核定位序列与G-6-P变构激活所需精氨酸富集簇重叠，隔离本身即可阻断激活，独立于磷酸化状态。离体实验中，链脲佐菌素糖尿病大鼠视网膜显示G-6-P升高六倍，糖原升高三倍，而磷酸化糖原合酶无变化。体内实验中观察到较小但显著的升高。这里，细胞特异性易感性指相邻视网膜细胞群体在相同系统性高血糖环境下损伤易感性的差异。特别地，无长突细胞在糖尿病中积累大量糖原，而邻近的神经节细胞主要保留核糖原合酶，糖原积累相对较少。大块核周糖原团块位于无长突细胞体高尔基体和内质网附近，可能干扰内质网-高尔基体转运、生物合成、突触传递和细胞支持，可能导致RPE内ROS通路激活和神经视网膜糖酵解控制点抑制。
2.2. 人类视网膜色素上皮中的糖原储存
视网膜色素上皮既是代谢守门员，也是外血-视网膜屏障的关键组成部分，负责向代谢需求高的光感受器输送底物。RPE可能约占视网膜葡萄糖转运的60%。在慢性高血糖条件下，相关应激信号和凋亡导致外层视网膜稳态失衡。来自糖尿病供体眼的全RPE裂解物中糖原记录为64.1 ± 16.7 μg/mg蛋白，对照组为42.4 ± 16.7 μg/mg蛋白（p < 0.05）。糖尿病患者的pGS与GS比值低于对照视网膜（0.33 ± 0.36 vs. 0.63 ± 0.44，p < 0.05），与较高的GS活性一致。ARPE-19细胞在25 mM葡萄糖条件下暴露20天后，糖原约增加一倍，且糖原负荷在恢复正血糖条件（5.5 mM）后可逆。高血糖条件持续增加ARPE-19细胞中GS活性。GP活性在25 mM条件下升高，表明高血糖条件下合成和分解能力同时上调。供体人RPE仅表达肌型GS亚型（GYS1），未检测到肝型（GYS2）表达。GYS1亚型主要受胞质G-6-P和多位点磷酸化调控，允许快速切换糖原合成。GP肌型和脑型亚型在人RPE中检测到，而ARPE-19仅表达脑型。GLUT1存在于培养RPE的顶膜和基底膜上，能够快速双向转运葡萄糖。高血糖条件增加JNK1/2和p38 MAPK磷酸化，提高ROS产生，进一步促进ARPE-19细胞凋亡/坏死。增加的葡萄糖流入与升高的糖原转换相关，助长氧化和内质网应激通路，导致RPE功能障碍，可能改变血-视网膜屏障信号传导和葡萄糖输送。
2.3. 糖尿病大鼠视网膜葡萄糖代谢分析
对链脲佐菌素处理的Sprague–Dawley大鼠（65 mg/kg，血清葡萄糖>17 mM）在3周和3个月时间点进行研究。采用原位微波照射保持瞬时视网膜代谢状态，双U-14C/5-3H葡萄糖示踪剂量化糖酵解与多元醇通路通量。糖尿病视网膜中游离葡萄糖和G-6-P底物池高于对照组。糖尿病视网膜游离葡萄糖浓度为232.3 ± 22.4 nmol/mg蛋白，正血糖对照组为59.0 ± 7.5 nmol/mg蛋白（p < 0.05）。G-6-P浓度：糖尿病0.98 ± 0.09 nmol/mg蛋白 vs. 正血糖0.68 ± 0.04 nmol/mg蛋白（p < 0.05）。尽管游离葡萄糖底物池大幅增加，G-6-P升高幅度相对较小，表明糖尿病条件下己糖激酶活性未随底物可用性线性扩展。糖酵解通量在糖尿病3周大鼠视网膜中在20 mM葡萄糖孵育时恢复至对照水平，但这种恢复在糖尿病3个月大鼠视网膜中缺失，表明进行性代谢损伤而非急性适应。乳酸与丙酮酸比值在糖尿病视网膜中未增加，不支持假性缺氧驱动机制。氚化葡萄糖示踪显示多元醇生成在20 mM葡萄糖条件下高于5 mM，糖尿病视网膜高于正血糖，糖尿病3个月高于3周，表明醛糖还原酶途径通量增强伴随糖酵解代谢受损。山梨醇/果糖生成消耗NADPH，增加渗透和氧化应激，形成前馈循环，进一步损害糖酵解酶。GAPDH活性在3个月时降低约22.3%，产生糖酵解中段瓶颈，尽管上游底物充足，仍限制糖酵解通量。GAPDH全视网膜对氧化和亚硝化修饰高度敏感，活性降低与氧化应激累积造成的酶损伤一致。
2.4. 视网膜糖原含量的变构调节
视网膜糖原水平主要受G-6-P对GS的变构激活调控，而非酶丰度或胰岛素信号传导的变化。正血糖视网膜中G-6-P浓度低（约14 pmol/mg蛋白），糖原含量中等（约43 nmol糖基残基/mg蛋白），糖原合酶和糖原磷酸化酶活性平衡（GS约1.08和GP约9.5 nmol·mg?1·min?1）。糖尿病视网膜中G-6-P浓度显著增加，糖原含量约增加三倍，但pGS或总GS浓度无差异，表明增强的糖原合成主要源于G-6-P介导的变构激活。对禁食大鼠进行单次腹腔葡萄糖负荷可提高血糖、升高视网膜G-6-P水平，随后增加GS活性和糖原合成。因此支持通过G-6-P/GS轴的直接葡萄糖依赖性控制，高血糖驱动视网膜净葡萄糖储存增加。由于葡萄糖-6-磷酸也供应磷酸戊糖途径，该代谢物转向糖原合成可能减少NADPH生成和谷胱甘肽再生的底物可用性，这与多元醇通路通量直接消耗NADPH共同提供了一种 plausible 机制，即改变的葡萄糖分配和糖原代谢可能导致视网膜氧化还原能力受损，但此关系尚未在糖尿病视网膜中直接量化。
3. 与氧化应激的相互作用
3.1. 氧化应激与DR
DR是劳动年龄成年人视力丧失的主要原因，慢性高血糖诱导ROS产生是疾病进展的核心介质。促成DR的氧化应激来源包括线粒体电子传递链电子泄漏、NADPH氧化酶（NOX2）激活、解偶联eNOS产生超氧化物以及通过AGEs/RAGE信号传导激活PKC-δ。线粒体是糖尿病视网膜中超氧化物的重要来源，但证据表明胞质ROS（来自NADPH氧化酶和解偶联eNOS）启动了该过程。在视网膜内皮细胞中，Rac1/NADPH氧化酶2激活在线粒体损伤之前，且线粒体铁死亡标志物仅在胞质标志物之后升高，与线粒体作为前馈级联中放大器而非触发器的角色一致。线粒体DNA（mtDNA）邻近ROS产生位点，易受损伤。光感受器含丰富线粒体，对DR中超氧化物形成有显著贡献。基质中产生的超氧化物带电荷且扩散性差，主要局限于基质内，通过锰超氧化物歧化酶歧化为过氧化氢，后者可跨线粒体膜，延伸氧化损伤范围。清除依赖线粒体谷胱甘肽过氧化物酶如GPx4，需要谷胱甘肽作为氢供体。醛糖还原酶消耗NADPH，直接耦合多元醇通路通量与线粒体过氧化物清除。多元醇通路激活涉及醛糖还原酶介导的葡萄糖转化为山梨醇并消耗NADPH，削弱谷胱甘肽依赖性抗氧化防御，山梨醇转化果糖增加胞质NADH/NAD+比值。谷胱甘肽是视网膜主要细胞内抗氧化剂。GPx4作用于膜脂质氢过氧化物，联系谷胱甘肽状态与膜脂质过氧化。NOX2在多种视网膜细胞群体中表达，健康视网膜中表达低，DR中过度激活，导致ROS产生增加和ICAM-1及VEGF表达增强。ICAM-1与白细胞β2整合素结合，粘附白细胞阻塞毛细血管并损伤内皮。链脲佐菌素糖尿病大鼠中ICAM-1抑制显著减少视网膜白细胞停滞和血管渗漏。VEGF通过VEGFR2信号传导增加occludin丝氨酸/苏氨酸磷酸化和zonula occludens-1酪氨酸磷酸化，松解内血-视网膜屏障紧密连接。当底物L-精氨酸或辅因子四氢生物蝶呤受限时，内皮型一氧化氮合酶解偶联，还原分子氧产生超氧化物而非一氧化氮。解偶联很少完全，同一酶可同时产生一氧化氮和超氧化物，以近扩散限制速率结合形成过氧亚硝酸盐，其氧化性更强、寿命更长、膜渗透性更高。糖尿病大鼠视网膜硝基酪氨酸免疫反应性增加，SOD模拟物tempol阻断糖尿病诱导的血-视网膜屏障破坏。慢性高血糖驱动蛋白质和脂质非酶糖化，产生AGEs和自由基。AGEs与RAGE相互作用激活PKC-δ和NADPH氧化酶，刺激线粒体ROS产生，增强NF-κB信号传导，促进AGE/RAGE信号、周细胞凋亡和VEGF上调。
3.2. 光暴露作为高血糖损伤的调节因子
光对具有降低抗氧化能力的视网膜（如糖尿病）施加持续生理性氧化负荷，修饰而非启动高血糖损伤。外层视网膜高氧张力和代谢率有利于部分氧还原；光感受器膜富含可过氧化的多不饱和脂肪酸；视黄醛循环和RPE来源荧光团A2E作为光敏剂。DR进一步加剧这种内在脆弱性，预先存在的高血糖诱导氧化应激放大光介导损伤机制。哺乳动物视网膜具有人体组织中最高的氧消耗率之一，但此环境促进部分氧还原，产生超氧化物自由基。光感受器外节含高浓度多不饱和脂肪酸（PUFAs），特别是二十二碳六烯酸（DHA），约占视网膜总脂肪酸的50%。DHA极易氧化降解，是ROS引发脂质过氧化反应的主要靶标。RPE细胞每日吞噬光感受器外节远端尖端，此清除过程依赖于衰老尖端暴露的磷脂酰丝氨酸及MERTK和整合素αvβ5受体，MERTK/TYRO3信号在清除过程中主动抑制炎症。培养的人RPE喂食分离外节显示氧化活性增加，但分离和标记可能改变膜。吞噬细胞样呼吸爆发在生理性更新中未被证明，更可能的是每日外节转换代表RPE上的持续氧化负荷而非ROS激增来源。在DR中，慢性高血糖进一步激活所有上述ROS生成系统，高血糖诱导氧化应激与光驱动ROS产生汇聚可能增加视网膜对光化学损伤的易感性。糖尿病相关抗氧化防御系统损伤进一步降低视网膜细胞中和代谢和光化学来源组合氧化负荷的能力。人类DR中外层视网膜相对抵抗，内层视网膜神经元和微血管受影响更早更严重，光感受器丢失主要在胰岛素缺乏啮齿动物模型中显著。
3.3. 高血糖诱导的VEGF和ROS产生
血管内皮生长因子（VEGF）是DR进展的关键介质，连接代谢应激与病理性血管生成和血管通透性变化。高血糖通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）稳定、AGE-RAGE信号传导和氧化应激介导的转录激活刺激VEGF表达。Kida等人证明高血糖通过机制上相连的通路同时诱导VEGF过表达和ROS产生。雷帕霉素对mTORC1的药理抑制有效减弱VEGF上调和ROS产生，确定mTORC1为连接葡萄糖诱导血管生成信号与氧化应激产生的中心调控枢纽。mTORC1抑制已被证明抑制肌肉组织糖原生物合成，部分由于糖原合酶磷酸化增加。氧化应激和VEGF直接相互强化。在MIO-M1人Müller细胞和离体小鼠视网膜外植体中，过氧化氢诱导VEGF表达，VEGF随后通过自身受体进一步驱动VEGF表达，形成自分泌环，该环被VEGFR2阻断消除。两条臂都需要HIF-1α，但只有初始氧化诱导是Nrf2依赖性的。升高的VEGF水平进一步增强ROS生成，稳定HIF-1α并放大VEGF表达。在糖尿病大鼠中，雷帕霉素抑制高血糖诱导的VEGF过表达并减少培养视网膜细胞中ROS积累。Wirostko等人提供关于糖尿病并发症中VEGF抑制的背景化说明。由于VEGF在血管稳态、伤口愈合和侧支血管形成中发挥重要作用，完全抑制VEGF介导的血管生成并不恰当。氧化应激-VEGF轴通过涉及可溶性VEGF受体-1（sFlt-1）的精细调控机制运作，sFlt-1作为内源性VEGF拮抗剂。氧化应激诱导长期表观遗传修饰，即使在血糖正常化后仍维持VEGF失调，包括VEGF启动子区域组蛋白甲基化改变和转录因子活性改变，允许VEGF过表达和氧化脆弱性持续。这种代谢记忆现象即使在血糖控制改善后仍维持DR进展。
3.4. 线粒体损伤与ROS生成
糖尿病中持续代谢应激扰乱线粒体稳态的多个方面，通过自我强化的前馈级联促进DR发生和进展。早期高血糖触发RAC1-NOX2复合物胞质激活，产生超氧化物诱导视网膜周细胞线粒体损伤。NOX2的药理阻断防止ROS扩增、脂质过氧化和caspase-3激活，支持NADPH氧化酶是视网膜微血管中线粒体功能障碍介导细胞丢失的关键因素。在视网膜内皮细胞和全大鼠视网膜线粒体中，氧化损伤优先靶向mtDNA，对复制和转录至关重要的位移环（D-loop）特别易感。随后，核编码复制体（POLG1/POLG2/Twinkle）的某些成分被表观遗传下调，停滞mtDNA生物发生并减少mtDNA拷贝数。POLG1或超氧化物歧化酶过表达恢复D-loop完整性并中断前馈氧化损伤级联。表观遗传抑制扩展到对线粒体质量控制至关重要的其他核基因。TFAM的表观遗传修饰与表达降低相关，线粒体融合蛋白-2的动态DNA甲基化和随后下调有利于线粒体分裂而非融合，使ETC不稳定并限制ATP输出。人类糖尿病视网膜和Ins2Akita小鼠均表现出明显的瞬时过度融合以缓冲生物能量应激，但糖尿病最终导致PINK1-线粒体自噬以及生物发生抑制。未清除的功能障碍线粒体在“代谢记忆”期间进一步损害线粒体更新。即使重新建立正血糖条件，线粒体自噬体和糖酵解通量仍受损，允许氧化过载和持续毛细血管变性。人视网膜内皮细胞中的铁死亡是一种受调控的铁依赖性细胞死亡，由膜脂质氢过氧化物积累驱动，不依赖caspases或BAX/BAK，被铁螯合或亲脂性抗氧化剂阻断，显示线粒体萎缩而非凋亡的核碎片化。氧化性脂质损伤将线粒体生物能量衰竭与铁死亡联系起来，高葡萄糖升高游离铁和脂质过氧化物同时抑制GPx4。GPx4在视网膜线粒体和胞质中发挥关键抗氧化防御功能。铁死亡损伤被NOX2抑制或铁死亡特异性抑制剂减弱，但被GPx4阻断加剧。这些线粒体紊乱的最终结果是视网膜线粒体从适应性可塑状态转向适应不良性耗竭，减少氧化磷酸化，改变底物利用，促进促凋亡因子泄漏，产生炎症和促血管生成通路，这是DR发病机制的核心。
4. 与炎症通路的相互作用
4.1. 线粒体细胞间信号传导与DR中的免疫激活
近期证据提出一种新型氧化-线粒体-免疫轴，慢性高血糖促进线粒体复合物I和III的电子泄漏，反映线粒体呼吸功能障碍。这种诱导的氧化应激触发独特的细胞反应。来自糖尿病黄斑水肿患者的补体启动血清已被证明可诱导完整的TOMM20阳性细胞外线粒体（exMT）释放。此过程被热灭活、抗C5抗体处理或抑制炎症细胞因子IL-1和IL-8所抑制。一旦释放到细胞外，exMT可发挥细胞毒作用并作为损伤相关分子模式。内吞的exMT通过组织蛋白酶D溢出和JNK激活使ARPE-19细胞溶酶体崩溃，导致溶酶体而非caspase介导的细胞死亡。此效应可通过药理DNA-PK抑制（Nu7441）或遗传PRKDC敲除来预防。同时，exMT已被提出在视网膜细胞（ARPE-19）中参与TLR9-PRKDC信号传导，导致JNK介导的溶酶体细胞死亡，并激活单核细胞来源巨噬细胞中的TLR9信号传导，大幅增强IL-1β和TNF-α分泌。因此，被排出的细胞器作为炎症放大器。循环mtDNA浓度的变化反映线粒体应激，轻度非增殖性DR期间mtDNA水平升高，晚期疾病中下降。mtDNA完整性恶化与晚期DR病例中系统性TNF-α和IL-4水平显著升高同时发生。使用孟德尔随机化的转录组学分析确定两个线粒体基因（PTAR1，香叶基香叶基转移酶亚基，和SLC25A34，内膜载体）作为候选因果血液学DR生物标志物（疾病区分AUC > 0.74），两个基因均与溶酶体和胰岛素信号通路相关。
4.2. 炎症
一项先前研究强调了氧化应激和相互抗氧化反应在DR发病机制中的作用。暴露于25 mM葡萄糖（高血糖条件）的大鼠Müller胶质细胞观察到Nrf2介导的抗氧化防御系统快速显著改变。在12小时内，细胞内ROS增加160%，并在超过48小时内保持升高，达到212%。活性氮物种更早升高，在1小时达到140%。Nrf2通路观察到双相反应，总Nrf2蛋白水平在3小时时迅速下降48%，尽管Keap1水平同时降低72%，随后逐渐恢复至48小时时基线的81%。主抗氧化调节因子的短暂抑制创造了细胞抗氧化防御受损的时期。核Nrf2转位同样被破坏，3小时时下降52%，随后在48小时时增加161%，而胞质Nrf2水平从69%逐渐下降至34%。关键Nrf2靶基因包括谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLc）、超氧化物歧化酶2（SOD2）和硫氧还蛋白（TXN）在1–24小时内显著降低，伴随过氧化氢酶活性降低（0.4–0.6 U/mg），然后在48小时时迅速增加至2.3 U/mg，对照过氧化氢酶活性为1.5 U/mg。早期Nrf2抑制与GSK3-β磷酸化和失活增加相关（1–3小时约150%）。尽管如此，尽管失活GSK3-β预期会增加Nrf2水平，但最初有显著下降。随后是NF-κB p65、iNOS和IL-1β炎症通路的激活。这一特定时间序列表明高血糖最初触发能够抑制抗氧化反应的炎症信号，产生氧化损伤易感窗口期。适应性反应确实出现，但约48小时的抗氧化恢复期可能代表干预最有效的关键窗口，以预防DR中不可逆视网膜损伤。
4.3. 硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）
基于Nrf2抑制建立的瞬时脆弱窗口，Devi等人确定硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）为损害硫氧还蛋白介导抗氧化能力的强效炎症介质，在机制上维持视网膜周细胞功能障碍。TXNIP被认为是代谢危险传感器，在高血糖条件下协调多种细胞防御程序中发挥重要作用。糖尿病4周后，全大鼠视网膜中TXNIP mRNA增加约4.6倍。培养视网膜细胞中的互补高葡萄糖实验显示持续TXNIP诱导伴随炎症通路激活。TXNIP siRNA敲低显著降低视网膜IL-1β和GFAP表达。时间动态同样显示双相炎症反应：高葡萄糖在2小时内触发快速TXNIP转录物增加，持续至24小时（较对照增加2–4倍）。Pro-IL-1β mRNA在2–4小时上升后下降，而NLRP3/Pro-IL-1β的周期性炎症小体再激活在2–4小时达到最大，24小时下降，在3–5天重新出现。尽管TXNIP表达持续升高（从2小时到5天约四倍），观察到ROS水平的短暂调节，可能反映早期内质网应激和未折叠蛋白反应激活。第3–5天的晚期ROS激增给细胞抗氧化能力带来压力，并与ATP耗竭相关，4小时瞬时升高后从24小时到5天持续耗竭（较对照减少约65%），表明线粒体生物能量受损。因此触发自噬活性代偿性增加，表现为beclin-1斑点增加、与线粒体自噬一致的线粒体染色增强以及LC3B-II斑点形成增加，TXNIP敲低可防止ATP耗竭和ROS积累并减少LC3B斑点。
4.4. 超氧阴离子与血-视网膜屏障破坏
血-视网膜屏障（BRB）功能障碍被归因于既是DR中炎症级联的结果又是其延续者。初始高血糖诱导的氧化应激主要通过ROS生成触发屏障破坏。随后发生VEGF介导的尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）上调，伴随β-catenin核转位增加和蛋白水解级联激活。此过程破坏内（内皮细胞伴周细胞支持）和外（RPE）BRB组分，内BRB显示VEGF诱导的紧密连接蛋白occludin和zonula occludens-1磷酸化。同时，TNF-α诱导的ICAM-1上调促进炎症细胞粘附。外BRB近来成为研究焦点，证明与RPE紧密连接中occludin耗竭相关的尺寸选择性大分子渗漏。糖尿病诱导显著occludin分解，占实验模型中总视网膜血管渗漏的可测量比例（约12%）。高血糖驱动的氧化应激特异性激活GSK-3β/β-catenin信号通路，导致β-catenin从粘附连接转位至细胞核，作为转录因子上调uPAR表达。这促进纤溶酶激活和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）释放，MMP-9破坏VE-cadherin和其他基底膜成分，不稳定细胞间连接并促进进一步炎症介质浸润。BRB破坏的意义不仅限于简单屏障功能障碍，它允许血浆蛋白和炎症细胞外渗，产生局部视网膜增厚区域。值得注意的是，视网膜增厚区域可能在屏障渗漏正常化之前出现或持续存在，表明即使部分恢复屏障完整性，炎症组织变化也可自我维持。炎症放大通过补体激活和激肽释放酶-激肽系统参与发生。B2受体刺激可促进eNOS激活和前列环素产生，B1受体激活产生过氧亚硝酸盐，建立促炎、促通透性环境以维持屏障功能障碍。AGE-RAGE结合促进Src激酶激活，导致VE-cadherin和β-catenin进一步磷酸化，创造多个重叠通路用于持续屏障损害。时间动态显示TNF-α早期瞬时升高，而VEGF和ICAM-1增加在DR进展中持续存在。大麻二酚已被证明通过p38 MAPK抑制减弱神经节细胞和内核层神经元中的此级联反应，防止氧化应激产生和下游炎症信号传导，同时保持紧密连接完整性并减少神经细胞死亡。超氧阴离子清除剂TEMPOL显著减弱糖尿病诱导的BRB破坏和uPAR表达，证明氧化应激是此炎症级联的关键上游驱动因素。
5. 未解决的问题
关于DR发病机制和进展，许多基本问题仍未解决。视网膜糖原积累是病理性的、保护性的还是代谢旁观者尚不清楚。积累是保护性还是病理性的未确定：糖原是局部储备，聚合过量葡萄糖限制进入多元醇和己糖胺通路的通量。然而，沉积物大、核周且邻近高尔基体，携带它们的细胞失去核pGS而邻近神经节细胞没有。病理学解释被偏向，但现有证据仍然是关联性的，未建立因果关系。这些沉积物不是多葡聚糖体：电镜显示它们是超微结构正常的β颗粒聚集体，不同于Lafora病的多葡聚糖或Pompe病的溶酶体糖原。从初始高血糖暴露到临床有症状DR的精确时间映射仍未完全明确，限制了早期干预策略。细胞类型特异性易感模式，特别是无长突细胞对糖原积累明显选择性易感而神经节细胞相对抵抗，值得机制研究以支持潜在靶向治疗策略。悖论在于糖原磷酸化酶在神经节细胞中强表达，但神经节细胞几乎不积累糖原，因此表达本身不能解释差异。不同GP和GS亚型对视网膜代谢调控的特异性贡献及其组织特异性亚型表达模式仍未完全表征。因此，了解靶向线粒体功能障碍、炎症通路、代谢失调或其组合是否重要，将指导DR治疗开发。最后，定义代谢记忆的分子基础并确定维持VEGF失调和氧化脆弱性的表观遗传修饰是否可逆转，可能使疾病修饰疗法超越症状管理得以发展。
6. 结论
糖尿病视网膜病变是一种复杂的多因素疾病，慢性高血糖引发相互关联的代谢、氧化、炎症和血管紊乱，进行性损伤视网膜。越来越多的证据表明视网膜代谢功能障碍不仅限于改变的葡萄糖可用性，还包括异常糖原代谢。视网膜无长突细胞中的病理性糖原积累，伴随磷酸化糖原合酶从细胞核向胞质的重新定位，可能破坏细胞内能量稳态、细胞器功能和细胞转运。视网膜色素上皮在糖尿病条件下也积累过量糖原，同时增加糖原合成和分解能力，提示增强的代谢循环可能进一步促进细胞应激。氧化应激是这些代谢异常与随后神经血管损伤之间的中心联系。线粒体电子传递链功能障碍、线粒体DNA损伤、NADPH氧化酶激活、多元醇通路通量、AGE–RAGE信号传导共同增加活性氧产生。这些过程被视网膜内在的高氧需求和丰富的易氧化多不饱和脂肪酸所加剧，增加脂质过氧化、铁死亡损伤和线粒体衰竭的易感性。同时，Nrf2依赖性抗氧化反应的短暂抑制可能创造早期易感窗口，在此期间ROS产生超过内源性保护能力。氧化还原失衡还放大VEGF信号传导、TXNIP–NLRP3炎症小体激活、补体相关线粒体信号传导和血-视网膜屏障破坏。这些相互强化的通路促进血管通透性、神经炎症、视网膜细胞死亡和代谢记忆，使视网膜损伤即使在血糖控制改善后仍持续存在。总之，证据支持糖尿病视网膜病变的整合代谢-氧化还原模型，其中失调的糖原代谢、线粒体功能障碍、抗氧化防御受损和炎症信号传导协同作用，而非孤立的致病机制。未来研究应确定视网膜糖原积累是直接致病性的、初期保护性的还是更广泛代谢衰竭的标志物，并定义连接代谢破坏与不可逆视网膜损伤的时间序列。阐明糖原处理、抗氧化能力和线粒体弹性的细胞特异性差异可能揭示早期生物标志物和治疗窗口。因此，有效的疾病修饰策略可能需要协调靶向代谢失调、氧化应激、抗氧化防御系统和炎症信号传导，而非依赖单一下游通路。
