强直性脊柱炎合并克罗恩病患者的循环T细胞与B细胞亚群综合表型分析

《Cells》：Comprehensive Phenotyping of Circulating T- and B-Cell Subsets in Patients with Ankylosing Spondylitis Associated with Crohn’s Disease

　　

背景：强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis, AS）合并克罗恩病（Crohn’s disease, CD）是脊柱关节炎（spondyloarthritis, SpA）的一种疾病类型，在人群中患病率较低。该病的发病机制尚未完全阐明，且在疾病早期缺乏精确的鉴别诊断方法以将AS合并CD与单纯AS及单纯CD区分开来。本研究的主要目标是明确AS合并CD患者中淋巴细胞介导的免疫特征。方法：本项预初研究招募了四组受试者：CD组（n = 16）、AS+CD组（n = 13）、AS组（n = 13）和健康对照组（HC，n = 26）。通过流式细胞术对外周血淋巴细胞进行免疫表型分析。结果：在AS+CD组中，循环调节性T细胞（regulatory T-cell, Treg）水平较其他组升高。在效应记忆（effector memory, EM）亚群中，CD73⁺ Treg的频率在AS+CD组中也较单纯AS组和单纯CD组升高。与此同时，AS+CD组的EM Tcyt和EM Th细胞群低于CD组。AS+CD组的Tfh17水平低于AS组，且与Bm5细胞和‘类别转换’记忆B细胞呈正相关。此外，Tfh17和‘类别转换’记忆B细胞与急性期标志物呈负相关，而Tfh2与BASDAI活动指数呈正相关。结论：在AS合并CD患者中，适应性免疫的调节性区室出现耗竭，而体液免疫区室似乎趋向于炎症反应的消退。

论文解读：强直性脊柱炎合并克罗恩病患者循环T细胞与B细胞亚群的综合性表型分析

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis, AS）是一种慢性炎症性疾病，属于脊柱关节炎（spondyloarthritis, SpA）范畴，以脊柱、外周关节和附着点受累为特征，胃肠道等骨骼外结构也可受累。克罗恩病（Crohn’s disease, CD）是一种炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD），除消化道表现外，还可累及中轴骨骼和/或外周关节等肠外部位。IBD相关性SpA是在炎症性肠病患者中出现的一种脊柱关节炎亚型。流行病学数据显示，高达50%的IBD患者存在肌肉骨骼表现，AS在IBD患者中的检出率为16%，影像学骶髂关节炎的检出率为12%–20%。反之，SpA患者也可出现IBD，约14%的AS患者存在IBD，且SpA患者中亚临床胃肠道受累很常见。尽管靶向IL-23/IL-17A治疗的有效提示III型免疫应答可能参与两种疾病，但IBD与SpA的免疫发病机制存在差异：在CD中IL-17A以IL-23依赖方式产生，而在AS中则为IL-23非依赖方式；AS中IL-17A的主要产生细胞为固有免疫细胞，而CD中为适应性免疫细胞。然而，在SpA合并IBD中发挥关键作用的免疫细胞表型尚未完全阐明。本研究的主要目的是明确AS合并CD患者外周血淋巴细胞的表型特征，并检测这些患者与单纯AS（无消化道受累）及单纯CD（无肌肉骨骼受累）患者之间淋巴细胞表型特征的差异。

研究人员共招募了四组受试者：CD组（n = 16）、AS+CD组（n = 13）、AS组（n = 13）和健康对照组（HC，n = 26）。所有组别的年龄和性别分布相似。AS诊断基于1984年改良纽约标准，并要求疾病处于活动期（BASDAI和ASDAS评分确认）；CD诊断由专科IBD中心胃肠病学家根据临床、实验室、内镜和形态学数据确立，并要求处于活动期（CDAI和Harvey–Bradshaw指数确认）；AS合并CD的诊断要求患者同时满足两种疾病的诊断标准。排除了肿瘤病史、妊娠、其他风湿病、慢性疾病急性期、急慢性感染性疾病以及大剂量糖皮质激素使用者。研究人员采用多色流式细胞术对三组患者外周血样本中的B细胞、T细胞和Treg亚群进行了免疫表型分析，并采用t分布随机邻域嵌入（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding, tSNE）降维方法分析细胞群的拓扑关系。统计学分析采用Mann–Whitney U检验进行非参数独立样本的两两比较，数据以中位数和四分位距表示。

在主要外周血淋巴细胞群方面，三组间T细胞和B细胞的绝对数与相对频率均无显著差异，但AS+CD组的Treg百分比显著高于CD组和AS组。CD组的循环Th频率高于AS组，而AS+CD组和AS组的Tcyt百分比低于CD组。在记忆亚群分析中，AS+CD组和AS组的Th记忆细胞频率低于CD组；AS+CD组的EM Th频率显著低于CD组。Tcyt记忆细胞频率在AS+CD组中低于CD组，EM Tcyt在AS+CD组和AS组中的相对百分比和绝对计数均低于CD组；AS+CD组的CM Tcyt和TEMRA Tcyt绝对计数亦低于CD组。tSNE图显示，AS+CD组和AS组中EM Tcyt和TEMRA Tcyt聚集在一起，而CD组中这两个群体占据不同的聚类。在‘极化’Th亚群方面，三组间Th1、Th2、总Th17、经典Th17、Th17.1、DN Th17、DP Th17和总Tfh的频率无显著差异，但AS组的Tfh1显著低于CD组和AS+CD组；AS+CD组的Tfh2高于CD组；AS+CD组的Tfh17低于AS组。在Treg亚群分析中，各患者组间‘初始’、CM、EM和TEMRA Treg亚群的分布无显著差异；但AS+CD组总CD39⁺ Treg频率低于AS组，总CD73⁺ Treg高于AS组；AS+CD组的CD39⁺ CM Treg低于AS组，而CD73⁺ EM Treg高于CD组和AS组。在B细胞分析中，AS+CD组患者的Bm5细胞和‘类别转换’记忆B细胞浓度低于CD患者。相关性分析显示，Bm5细胞和‘类别转换’记忆B细胞均与Tfh17亚群呈强正相关。研究还发现CRP与Tfh17呈负相关，ESR与‘类别转换’记忆B细胞呈负相关，而BASDAI与Tfh2呈正相关。与健康对照的比较显示，各患者组与健康对照之间存在显著的淋巴细胞亚群差异，呈现不同的免疫失调模式。

本研究首次系统评估了AS合并CD患者外周血T细胞和B细胞亚群组成，并将之与单纯AS和单纯CD患者进行比较。研究人员推测，AS合并CD患者外周血中Treg频率升高可能反映了多个受累部位（中轴骨骼、外周关节和肠道）的炎症活动程度；CD39/CD73表达失衡可能反映了嘌呤能稳态的破坏和炎症相关的代谢重编程。EM Tcyt的减少及其在tSNE图上与TEMRA Tcyt的聚集可能提示效应T细胞群的致关节炎作用，这与HLA-B27限制性关节源性肽识别的研究一致。EM Th与zonulin的正相关性提示该细胞群可能向肠道炎症灶迁移。Tfh17和‘类别转换’记忆B细胞的减少及其与急性期标志物的负相关，提示这两种细胞群可能迁移至肠黏膜炎症灶，通过产生分泌型IgA发挥抗炎作用。Tfh2与BASDAI的正相关提示其可能参与纤维化组织和关节强直的形成。

本研究的局限性包括样本量较小、组间异质性、缺乏严格的统计学校正以及对多重检验未进行校正；多变量分析因样本量限制未进行；缺乏验证队列；无法获取病变部位（肠道、关节、附着点）的生物材料；未进行体外功能学实验；Th17鉴定未评估CD161表达，Treg鉴定未评估CD127表达。

研究结论：在这项预初研究中，研究人员识别出AS合并CD这一脊柱关节炎表型中最具特征性的T细胞和B细胞表型改变。研究结果提示，T细胞介导的适应性免疫改变可能具有慢性促炎性质，并可能伴随调节性成分的某种程度耗竭。该疾病中适应性免疫体液成分的变化可能具有代偿性质，可能反映了炎症消退的尝试。未来需要更大规模的研究来深入理解可能构成该疾病发病基础的自身免疫反应。该论文发表于《Cells》。