《International Journal of Molecular Sciences》：Sediments Microfungi Diversity in the Dem?novská Ice Cave: A Combined Morpho-Molecular Approach with Edaphic N, P, K, C and pH Factors
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地下环境代表极端寡营养生态系统，其中微气候和土壤因子限制微生物生命活动。本研究评估了德马诺夫斯卡冰洞（Dem?novská Ice Cave）土壤和沉积物样品中可培养真菌群落，以确定其在嗜冷（5 °C）和中温（24 °C）培养温度下的空间多样性和丰度，并探讨其
地下环境代表极端寡营养生态系统，其中微气候和土壤因子限制微生物生命活动。本研究评估了德马诺夫斯卡冰洞（Dem?novská Ice Cave）土壤和沉积物样品中可培养真菌群落，以确定其在嗜冷（5 °C）和中温（24 °C）培养温度下的空间多样性和丰度，并探讨其与土壤和沉积物化学性质的关系。采用形态-分子相结合的方法，共鉴定出19种真菌，其中子囊菌门（Ascomycota）和青霉属（Penicillium）在分类学上占据显著优势。培养温度作为主要的选择性过滤因子。在5 °C条件下，专性冷适应真菌（枝孢属 Cladosporium cladosporioides 和假裸囊菌属 Pseudogymnoascus）在地下沉积物中的丰度高于地表样品。相反，在24 °C培养条件下，地下样品中的真菌丰度和多样性降低，大多数真菌生长出现在室外对照点的地表样品中。统计分析表明，在24 °C条件下，真菌丰度与全氮（r = 0.909）、速效钾（r = 0.878）和总有机质（r = 0.757）显著相关。然而，在嗜冷条件下，这些营养驱动的相关性不再被观察到，洞穴内部呈现不显著的交互作用。这些发现表明，地下微气候的稳定性，而非局域养分丰度，决定了冰洞真菌区系的生态和分布动态。此外，洞穴沉积物和土壤可携带机会性致病菌和产毒病原体，包括通常与唑类抗性相关的属。
**论文解读：德马诺夫斯卡冰洞沉积物微型真菌多样性及其环境驱动因子研究**
**1. 研究背景与科学问题**
地下洞穴生态系统是典型的极端寡营养环境，其生物过程受相对稳定的物理化学参数调控，包括永久无光、高相对湿度和低且季节性波动小的温度。洞穴真菌区系高度依赖地表周期性外源输入，并可能包含由游客引入的条件致病类群。冰洞为研究土壤和沉积物中可培养真菌生态学提供了独特场所，因为低温作为主要环境过滤因子调控真菌的生长、生理适应和存活。德马诺夫斯卡冰洞（Dem?novská Ice Cave）是斯洛伐克游客访问量最大的地下景点之一，其常年低温微气候与持续游客压力叠加，使其成为研究这些交互胁迫因子的理想模型系统。尽管该洞穴的空气真菌以及嗜角蛋白和角蛋白分解真菌群落已有报道，但土壤-沉积物界面的功能动态仍知之甚少。此外，洞穴是蝙蝠的重要栖息地，蝙蝠作为微生物的生物载体并通过鸟粪提供浓缩有机物，局部促进真菌生长。地下沉积物作为真菌繁殖体的长期库，整合了来自空气、水、人类和穴居动物的外部输入及局地上壤变异。因此，分析土壤-沉积物真菌区系可提供比季节性变化大的空气真菌学样品更稳健的真菌多样性和群落稳定性概览。
已有研究表明，地下系统常呈现复杂空间梯度：地表环境富含大量营养元素和有机物，而洞穴内部通常高度缺乏有机物，从最外缘的极端寡营养过渡到最内部的局域有机质积累。洞穴适应型真菌区系表现出在极端营养限制下生存和定植的显著进化能力，常与局域底物丰富度完全统计解耦。为绘制这些复杂动态并分离功能生态型，洞穴真菌学调查通常采用多温度培养策略，该方法既可作为选择性分离手段，也可作为区分真正嗜冷/耐冷地下特化种（如Cladosporium和Pseudogymnoascus）与暂存中温/耐热地表污染物的生态诊断工具。后者常携带具有医学、兽医和农业意义的机会性病原体，包括唑类抗性菌株、皮肤真菌病病原、致敏生物气溶胶和能够通过次级生物合成基因簇合成危险真菌毒素（如棒曲霉素和环匹阿尼酸）的产毒霉菌。
本研究的主要目标是对德马诺夫斯卡冰洞土壤和沉积物样品中的微型真菌群落进行全面评估，具体包括：（1）多个采样点的空间多样性；（2）不同温度培养阈值下的丰度和分类结构；（3）选定土壤因子对地下群落的影响。该工作扩展了此前仅关注嗜角蛋白和角蛋白分解真菌及空气真菌学调查的研究，通过将此前未探索的土壤-沉积物界面与整体物种库整合，并将生物学数据与土壤化学关联，填补了该洞穴地下生态学的关键知识空白。
**2. 主要关键技术方法**
研究人员采用形态学与分子生物学相结合的方法对真菌进行鉴定。分子鉴定基于核糖体DNA内转录间隔区（ITS rDNA）序列分析，使用ITS1/ITS4引物对进行PCR扩增，产物经纯化后由Macrogen Europe测序，所得序列通过BLAST算法与GenBank数据库比对，序列一致性≥97%时接受属和种名。样品在5 ± 0.5 °C和24 ± 0.5 °C两个温度阈值下于PDA培养基上培养5至42天，以分别分离嗜冷/耐冷真菌和中温真菌。培养后计数菌落形成单位（CFU·g?1），并采用单孢分离法纯化菌株。土壤化学分析包括pH（H2O和KCl）电位测定、总凯氏氮测定、Egner–Riehm法测定总磷和钾含量、以及有机碳分析仪测定有机碳并乘以1.724换算系数计算腐殖质（有机质）含量。数据分析采用Shannon多样性指数（H）、标准化z分数和Pearson相关系数（α = 0.05）。样品于2022年采集自德马诺夫斯卡冰洞的8个采样点（1个洞外、7个洞内），其中采样点I为室外对照点，采样点II至VII依次分布于洞穴内部。
**3. 研究结果**
**3.1 真菌采样概况**
从7个采样点（1个洞外、6个洞内）采集土壤和沉积物样品，在PDA培养基上于5 ± 0.5 °C和24 ± 0.5 °C两种温度下培养，共获得可培养真菌。
**3.2 分类学分类与分子鉴定**
ITS区域测序获得351至582 bp片段，BLAST分析显示所有分离株均达到100%查询覆盖率和99.05%至100.00%的序列一致性。共鉴定出19种真菌（GenBank登录号PZ770540-PZ770558），群落以子囊菌门（Ascomycota）为主导（17种，89.5%），另有2种属于毛霉门（Mortierellomycota）：Linnemannia elongata和Mortierella alpina。属水平上Penicillium占比最大，占全部记录生物多样性的近三分之一，包括P. camemberti、P. chrysogenum、P. commune、P. echinulatum、P. griseofulvum、P. restrictum和P. swiecickii。
**3.3 底物理化性质与养分特征**
所有样点底物呈相对稳定的碱性（pH H2O 8.32-8.62；pH KCl 7.82-8.53），最高pH出现在最内部样点VII。有机质含量在洞外与洞内呈现鲜明对比：洞外样点I富含有机碳（5.02%）和总有机质（8.65%），而洞内平均仅1.28% OC和2.21%有机质。最外部样点II和III极度寡营养（≤0.57%总有机质），最内部样点VII积累有机沉积物达4.03% OC和6.95%有机质。全氮和速效钾在洞外较高，而全磷呈相反分布模式，洞内平均30.68 mg·kg?1且峰值出现在样点VII。
**3.4 真菌物种丰富度与α多样性**
在5 °C培养条件下，室外对照样点I拥有最高物种丰富度（12种，H = 0.730），洞内过渡带样点VI（7种，H = 0.748）和样点II（6种，H = 0.421）多样性较高，而样点IV仅分离出1种且多样性指数完全受抑（H = 0.000）。24 °C培养导致洞内大部分区域多样性严重受抑，室外样点保持相对丰富（8种，H = 0.676），样点IV最低（1种，H = 0.000）。综合两个温度阈值，室外样点I共汇集15种（H = 0.980），洞内样点VI（10种，H = 0.819）和样点VII（9种，H = 0.600）为重要地下多样性热点，样点IV仅2种（H = 0.057）。
**3.5 培养温度效应与空间分区**
在5 °C下，全部19种中培养出14种（7种特有、7种共享）；24 °C下培养出12种（5种特有、7种共享）。室外独立分析中，15种包含3种中温特有和7种嗜冷特有。洞内16种中，5 °C支持8种特有，24 °C支持5种特有，仅3种能在两种温度下生长。空间效应方面，合并温度参数后室外与洞内共享12种；5 °C下14种中9种共享；24 °C下12种呈完美对称分布（4种室外特有、4种共享、4种洞内特有）。
**3.6 定量生物量积累**
5 °C培养下，洞内沉积物真菌数量超过地表基线，样点II最高（215.0 CFU·102 g?1），样点V次之（118.0 CFU·102 g?1），室外对照为68.0 CFU·102 g?1。24 °C培养则完全反转，室外样点I升至103.6 CFU·102 g?1，而所有洞内样点降至10.0 CFU·102 g?1以下，样点IV最低（0.3 CFU·102 g?1）。累计值确认样点II（217.9）、样点I（171.6）和样点V（124.4）为主要生态热点。
**3.7 标准化空间性能评估（z分数）**
5 °C培养下平均真菌丰度（M = 68.6 CFU，SD = 75.5）高于24 °C（M = 19.6，SD = 37.17）。5 °C下样点II为最高异常值（z = 1.94，97.4百分位），室外样点I几乎完全对齐基线（z = ?0.01）。24 °C下室外样点I成为关键异常值（z = 2.26，98.8百分位），而所有洞内位置均聚簇低于基线平均，处于30至40百分位之间。
**3.8 分类结构与群落组成**
室外群落以P. griseofulvum（23.49%）、M. alpina（16.60%）、C. cladosporioides（12.53%）和P. chrysogenum（11.74%）为主。洞内群落发生分类学转变，C. cladosporioides以58.91%占据绝对优势。5 °C下洞内高生物量主要由C. cladosporioides驱动，种群在样点II和样点V达到峰值；深层寡营养带以Pseudogymnoascus属为主。24 °C诱导群落更替，真菌增殖主要限于室外样点，洞内稀疏群落依赖Cosmospora viridescens，而真正的洞穴特化种如Pseudogymnoascus被完全抑制。
**3.9 环境相关性与底物驱动因子**
在24 °C培养阈值下，真菌丰度与全氮（r = 0.909，p = 0.005）、速效钾（r = 0.878，p = 0.009）和总有机质（r = 0.757，p = 0.049）呈显著正相关。在5 °C嗜冷条件下，这些正相关的营养驱动关系完全解耦，所有分析土壤参数均为弱且统计不显著的交互作用。合并数据的总体分析未检测到显著关系，总磷呈最强但非显著的负相关趋势（r = ?0.605）。
**4. 讨论与结论**
讨论部分指出，洞穴沉积物并非被动储存库，而是特定真菌区系组分的主动选择性边界。子囊菌门的绝对优势反映其在全球地下数据中的普遍性，Penicillium属的高占比归因于其超稳定产孢动力学和抵抗低水活度与严重营养限制的能力。有机质在洞内外的大幅极化表明典型的异源依赖型生态系统，而最内部样点VII的有机质积累提示其作为地质陷阱或沉积汇的功能。温度作为主要过滤因子的结论得到Shannon多样性指数变化的有力支持。真正的洞穴特化种如Pseudogymnoascus对中温高度敏感，表明即使微小的微气候改变也可能导致本土冷适应真菌区系的生物量崩溃。最关键发现是嗜冷条件下营养驱动关系的完全缺失，表明洞穴特化真菌区系的分布和生长动态严格受微气候稳定性和低温条件支配，而非养分丰富度。此外，研究鉴定出对人类健康构成潜在威胁的物种，包括机会性和潜在唑类抗性病原体——烟曲霉（A. fumigatus）和塔宾曲霉（A. tubingensis）、皮肤癣菌——羽绒状假裸囊菌（P. pannorum）、致敏生物气溶胶组分（Cladosporium和Penicillium）以及产毒霉菌（Penicillium）。
研究结论总结如下：本研究证实德马诺夫斯卡冰洞中嗜冷洞穴适应型真菌菌株与中温地表污染物之间存在明确的生理边界。在嗜冷条件（5 °C）下，地下沉积物支持特化耐冷真菌（如C. cladosporioides和Pseudogymnoascus spp.）的增殖，且不受局域养分浓度限制；暴露于中温阈值（24 °C）则触发洞穴内严重的生物量和生物多样性崩溃，证实真正的洞穴真菌特化种受高温抑制。此外，室外环境真菌发育受底物丰富度调控，与全氮、速效钾和有机质呈显著正相关，而这些关系在洞穴系统内完全解耦，突出特化洞穴真菌区系在极端寡营养约束下生存和定植的进化能力。这些发现强调地下微气候稳定性而非养分丰度可能决定冰洞真菌区系的生态动态。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》，为理解极端寡营养地下生态系统中真菌多样性维持机制及微气候稳定性对群落结构的决定性作用提供了重要实证。
