《International Journal of Molecular Sciences》：A Single-Cell Transcriptional Landscape of Emphysema: Heterogeneous Cellular Dynamics in Centrilobular, Panlobular, and Paraseptal Subtypes
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肺气肿是一种以不可逆肺泡破坏为特征的慢性肺部疾病，具有不同的影像学亚型——小叶中央型肺气肿（centrilobular emphysema, CLE）、全小叶型肺气肿（panlobular emphysema, PLE）和间隔旁型肺气肿（paraseptal
肺气肿是一种以不可逆肺泡破坏为特征的慢性肺部疾病，具有不同的影像学亚型——小叶中央型肺气肿（centrilobular emphysema, CLE）、全小叶型肺气肿（panlobular emphysema, PLE）和间隔旁型肺气肿（paraseptal emphysema, PSE）。驱动亚型特异性发病机制的细胞和分子机制仍知之甚少。在本研究中，研究人员对来自9例患者（每种亚型3例）的肺气肿肺组织进行了单细胞RNA测序，以绘制CLE、PLE和PSE的转录组图谱。通过对84，704个高质量细胞进行分析，研究人员鉴定了8种主要细胞类型，随后的亚聚类分析揭示了亚型富集的细胞群体和转录特征。CLE的特征是纤毛细胞中炎症通路上调，以及活化的巨噬细胞-上皮/成纤维细胞串扰，提示其具有气道源性感染和炎症表型。在PLE中，具有增强细胞毒性作用的自然杀伤T（natural killer T, NKT）细胞和1组先天淋巴样细胞（group 1 innate lymphoid cells, ILC1s）比例增加，间皮细胞表现出细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相关基因的上调，表明先天免疫细胞功能障碍和间皮细胞修复异常。PSE表现出显著的ECM重塑特征，全身静脉内皮细胞比例增加，成纤维细胞-上皮细胞相互作用增强。总的来说，研究人员的发现揭示了CLE主要由气道源性炎症驱动，PSE表现出纤维化样重塑表型，而PLE则代表先天免疫激活和基质失调的中间状态，为亚型特异性治疗靶向提供了单细胞分辨率框架。
**肺气肿亚型异质性的单细胞转录组学解读**
**一、研究背景与科学问题**
肺气肿是一种以终末细支气管远端气腔异常持久性扩大为特征的慢性肺部疾病，常伴随肺泡壁结构的破坏。作为慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的重要组成部分，肺气肿在普通人群中的检出率约为8.7%，而在存在气流受限的个体中可超过30%。其结构损伤导致肺弹性回缩力丧失、气体交换面积减少和肺顺应性增加，最终引起进行性呼吸困难和运动能力受损。肺气肿的发生涉及吸烟暴露、空气污染、遗传易感性和慢性气道炎症等多重因素，分子机制层面则涵盖蛋白酶/抗蛋白酶失衡、氧化应激增加、细胞程序性死亡与自噬失调以及组织修复受损等过程。由于肺泡结构破坏不可逆且有效药物治疗手段有限，深入阐明其潜在分子机制具有重要意义。
根据肺泡破坏的解剖位置，肺气肿被分为小叶中央型肺气肿（centrilobular emphysema，CLE）、全小叶型肺气肿（panlobular emphysema，PLE）和间隔旁型肺气肿（paraseptal emphysema，PSE）三种亚型。既往研究主要集中于基于影像学的评估和患者临床预后分析，仅少量研究探讨了亚型间免疫细胞浸润差异，如PSE较CLE具有显著更高的中性粒细胞浸润和更少的肥大细胞。然而，针对不同肺气肿亚型分子和细胞通路的机制性研究仍然十分有限。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术能够在单细胞分辨率下进行基因表达谱分析，揭示细胞异质性和特定分子变化。此前针对COPD患者肺组织的scRNA-seq研究已揭示细胞特异性机制，并强调小气道区域免疫失调在COPD发病和进展中的关键作用，但聚焦于肺气肿亚型间异质性的scRNA-seq研究仍属空白。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。
**二、研究设计与关键方法**
研究人员招募了因肺癌接受肺切除术的肺气肿患者，由两名独立呼吸科医生依据胸部计算机断层扫描（computed tomography，CT）判定肺气肿亚型，共纳入9例患者（每种亚型3例），采集无肿瘤浸润的肺气肿肺组织样本。基于10x Genomics平台构建单细胞3′基因表达文库，并在Illumina NovaSeq 6000平台完成测序。数据经Cell Ranger（版本9.0.0）比对至人类参考基因组GRCh38，随后使用Seurat R包（版本4.0.0）进行质控、标准化和降维聚类。细胞注释采用SingleR结合已知谱系标志物进行交叉验证。差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）分析使用FindMarkers函数，功能富集分析采用clusterProfiler包进行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析。此外还应用了Monocle2和CytoTRACE进行拟时序和分化潜能分析，采用Gene Set Variation Analysis（GSVA）评估通路富集特征，并使用CellChat V2进行细胞间通讯推断。为验证结果的稳健性，研究人员还进行了患者水平伪bulk差异表达分析和基于GSE196638数据集的健康肺组织外部验证。
**三、主要研究结果**
**3.1 三种肺气肿亚型的细胞异质性和全局转录组特征**
经过严格质控，共纳入84，704个高质量细胞。依据经典谱系标志物鉴定出8种主要细胞类型：上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞和肥大细胞。CLE和PLE的巨噬细胞频率高于PSE，而PSE的间充质细胞和肥大细胞频率高于CLE和PLE，但差异未达统计学显著水平。CLE与PLE比较中，CLE显著上调基因富集于抗原加工呈递、细胞因子介导信号通路、炎症反应和免疫应答。PSE与CLE比较中，PSE显著上调基因富集于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组织和ECM-受体相互作用。
**3.2 CLE：气道源性感染和炎症通路上调**
上皮细胞亚聚类获得9个亚群，包括肺泡2型上皮细胞（alveolar type 2 epithelial cells，AT2）、纤毛细胞#1、肺泡1型上皮细胞（alveolar type 1 epithelial cells，AT1）、杯状细胞、club细胞等。CLE中AT2比例低于PLE，而纤毛细胞#1富集。CLE纤毛细胞中多个炎症相关基因（如CXCL8、NFKBIA、FOS、JUND）上调，功能富集分析显示这些基因主要涉及炎症、中性粒细胞脱颗粒、凋亡负调控和抗原加工呈递。间充质细胞聚类获得5个亚群，CLE中外膜成纤维细胞富集且呈现炎症、衰老和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号相关基因上调。所有巨噬细胞亚型在CLE中均被激活，与PLE相比，SPP1、CCL18、SCGB1A1和NAMPT等DEGs共享表达。细胞间通讯分析显示CLE中巨噬细胞与上皮细胞和成纤维细胞的相互作用显著增强，其中MIF-（CD74-CXCR4）轴差异最为显著。
**3.3 PLE：先天免疫激活与间皮细胞增加**
T细胞亚聚类获得9个亚群，PLE中自然杀伤T（natural killer T，NKT）细胞和1组先天淋巴样细胞（group 1 innate lymphoid cells，ILC1s）比例高于CLE，而组织常驻CD8+ T细胞和初始T细胞比例降低。NKT细胞富集细胞杀伤、溶胞作用、颗粒酶介导的程序性细胞死亡等细胞毒性程序，ILC1细胞富集溶细胞和脱颗粒通路。PLE中间皮细胞显著增加，CytoTRACE分析显示其分化状态最低、保留分化潜能，ECM-受体相互作用、局部黏附、ErbB信号通路、PI3K-Akt信号通路等上调，PRG4、PLA2G2A、CD44、CCN1、COL1A1和COL1A2等ECM相关基因显著差异表达。PLE中性粒细胞中迁移趋化（CSF3R、ICAM1、CXCL8）、病原体识别吞噬（TLR4、FCGR3B）、细胞毒性和降解（NCF1、MMP9）以及中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）形成（PADI4）相关基因显著上调。
**3.4 PSE：ECM修复失调**
内皮细胞聚类获得6个亚群，包括全身静脉内皮细胞、淋巴内皮细胞、肺静脉内皮细胞、动脉内皮细胞、通用毛细血管内皮细胞和Aerocytes。PSE中全身静脉内皮细胞比例高于CLE，且显示最低分化状态。INHBB、SERPINE1、COL1A1、PXDN、CDH13和CCN2等基因在PSE全身静脉内皮细胞中显著上调。PSE中闰质巨噬细胞和cMonocyte比例升高，肺泡巨噬细胞比例降低。SPP1、LGMN、MFN1、CHIT1、MMP7、CTSK和CHI3L1等基因在PSE闰质巨噬细胞中显著增加。PSE外膜成纤维细胞中ECM-受体相互作用、局部黏附、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G（cGMP-PKG）信号通路、环磷酸腺苷（cAMP）信号通路、PI3K-Akt信号通路和蛋白质消化吸收等通路富集。细胞间通讯分析显示PSE中成纤维细胞与上皮细胞和巨噬细胞的相互作用显著增强，ECM-受体相互作用显著上调，包括LAMA2-CD44、COL6A2-CD44、COL1A2-CD44和COL1A1-CD44配体-受体对。
**3.5 敏感性分析**
患者水平伪bulk分析在总体上支持了主要发现：CLE巨噬细胞亚群富集免疫和炎症相关生物学过程；PSE中SPP1、CHIT1、MMP7和CTSK仍显著差异表达，ECM相关通路富集与主分析一致。基于GSE196638的外部验证显示，CLE与健康对照相比富集细菌侵入上皮细胞、纤毛蛋白定位调控和细胞衰老相关通路；PLE中FCGR3B、PLA2G2A和EGR2表达增加，支持中性粒细胞、间皮细胞和NKT细胞相关改变；PSE与健康对照相比表现出TGF-β信号、整合素信号、ECM-受体相互作用、局部黏附和ECM组织等通路的富集，进一步支持ECM重塑作为PSE的核心分子特征。
**四、总结与讨论**
该研究首次对肺气肿不同亚型进行了全面的单细胞转录组学比较分析。讨论部分指出，CLE代表一种炎症富集的肺气肿亚型，涉及上皮、免疫和基质 compartments 的协调改变。纤毛细胞功能障碍可能作为CLE的炎症触发因素，通过纤毛细胞、巨噬细胞和成纤维细胞间的相互作用，气道源性炎症信号可能促进成纤维细胞衰老和组织修复受损。PLE表现为混合表型，涉及中性粒细胞、NKT细胞和ILC1s驱动的失调先天免疫应答，以及间皮细胞ECM稳态失衡。间皮细胞凭借其祖细胞样特性和增强的ECM相关活性，可能导致PLE中异常基质重塑和组织结构破坏。PSE较CLE表现出更显著的ECM重塑和促纤维化特征，全身静脉内皮细胞呈现促纤维化和易重塑表型，闰质巨噬细胞在组织重塑和纤维化中发挥重要作用，重现了纤维化性肺部疾病的若干特征。敏感性分析总体支持主要生物学程序的稳健性。
研究结论指出，肺气肿亚型在机制上具有异质性：CLE主要由气道源性炎症驱动，PSE表现出重塑和纤维化样表型，而PLE代表先天免疫激活和基质失调的中间状态。该研究存在样本量较小、scRNA-seq对稀有细胞群体检测敏感性有限、未直接测量蛋白质丰度和空间定位信息以及缺乏匹配的健康肺对照等局限性，未来需要更大规模独立队列和匹配的健康肺样本进一步验证亚型特异性分子程序。
