《International Journal of Molecular Sciences》：All-Trans Retinoic Acid and Curcumin Exhibit Hormesis or Synergistic Anticancer Effects in U87 Glioblastoma Cells: Defining the Proteome Accompanying Synergism
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摘要翻译：胶质母细胞瘤（GBM）患者的生存状况持续不佳，因此有必要更深入地阐明肿瘤的药物应答机制。研究人员在观察到低剂量姜黄素和全反式维甲酸（ATRA）可刺激U87 GBM细胞增殖并相互抵消对方高剂量抗增殖效应后，进一步研究了药物对细胞生长、迁移和死亡的影响，
摘要翻译：胶质母细胞瘤（GBM）患者的生存状况持续不佳，因此有必要更深入地阐明肿瘤的药物应答机制。研究人员在观察到低剂量姜黄素和全反式维甲酸（ATRA）可刺激U87 GBM细胞增殖并相互抵消对方高剂量抗增殖效应后，进一步研究了药物对细胞生长、迁移和死亡的影响，以及抗增殖相互作用蛋白质组。细胞增殖和迁移通过xCELLigence实时细胞分析（RTCA）评估。细胞死亡通过流式细胞术界定。药物相互作用通过CompuSyn软件（版本1.0）确定。液相色谱–串联质谱（LC-MS/MS）、高效液相色谱（HPLC）和SequestHT软件（版本1.4）用于肽段生成和鉴定。高剂量ATRA更有效地抑制细胞生长和迁移。姜黄素在低剂量下表现出更强的促增殖作用，并对抗生长效应具有拮抗作用。在最高药物剂量下，迁移抑制和凋亡协同发生。ATRA对蛋白质组的影响更为显著，降低了转化生长因子β诱导蛋白（TGFBI）、磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）、腱糖蛋白（tenascin）和死骨片1（SQSTM1）的表达。除SQSTM1外，这些效应均被姜黄素缓解。葡萄膜自身抗原含卷曲螺旋结构域和锚蛋白重复序列（UACA）以及Sad1和UNC84结构域包含蛋白2（SUN2）在ATRA和姜黄素单独处理下表达升高，联合处理下升高程度较低。己糖激酶2（HXK2）在姜黄素及联合处理下表达升高。血红素加氧酶1（HMOX1）在联合处理下表达显著降低，但单独用药时无变化。SQSTM1和HMOX1的降低可能介导抗癌协同作用，而其余变化可能提示尚存的毒物兴奋效应通路，这些通路未反映在细胞计数中。
**论文解读：ATRA与姜黄素在U87胶质母细胞瘤细胞中毒物兴奋效应与协同抗癌作用的蛋白质组学解析**
**1. 研究背景与目的**
胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是中枢神经系统最具侵袭性的恶性肿瘤，被世界卫生组织（WHO）归类为4级。尽管采用手术联合放疗及替莫唑胺（temozolomide, TMZ）化疗的综合治疗方案，患者中位生存期仍仅为12至15个月，五年生存率低于10%，提示现有治疗策略的局限性。肿瘤耐药机制的复杂性是导致治疗失败的重要原因，而毒物兴奋效应（hormesis）作为一种适应性剂量反应，即低剂量应激源改善细胞性能而高剂量产生毒性，被认为是肿瘤细胞抵抗力的重要机制之一。然而，关于在低剂量下相互拮抗、高剂量下协同抗癌的药物组合研究仍相对匮乏。
全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）是维生素A的活性代谢产物，在急性早幼粒细胞白血病分化治疗中已获临床应用。在GBM中，高剂量ATRA可促进分化、降低干性及O
6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）表达。姜黄素（curcumin）是姜科植物姜黄中的酚性色素，具有抗氧化、抗炎和抗癌活性，其抗肿瘤效应与抑制NF-κB和PI3K/Akt/mTOR通路、诱导活性氧（ROS）介导的DNA损伤及凋亡相关。两者均对胶质瘤干细胞样细胞（SLGCs）或胶质瘤起始细胞（GICs）具有显著诱导分化作用，且纳米颗粒介导的共递送在GBM中展现出协同抗肿瘤潜力。然而，联合治疗所伴随的蛋白质组整体变化尚不明确，传统的靶向研究方法难以捕捉广泛而相互关联的分子改变。因此，本研究旨在详细描绘ATRA与姜黄素在U87 GBM细胞中的细胞生长模式、死亡与迁移特征，并利用蛋白质组学手段解析协同抗癌效应背后的分子机制，为理解GBM药物应答提供更全面的视角。
**2. 技术方法**
本研究采用多种技术手段。细胞增殖与迁移实时监测通过xCELLigence Real-Time Cell Analysis（RTCA）系统完成。细胞死亡模式通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术界定。药物相互作用类型（协同、相加或拮抗）采用CompuSyn软件（版本1.0）计算联合指数（CI）确定。蛋白质组学分析运用液相色谱–串联质谱（LC-MS/MS）和高性能液相色谱（HPLC），结合SequestHT软件（版本1.4）进行肽段鉴定，并通过MaxQuant软件进行无标记定量（LFQ）。差异表达蛋白的通路和分子功能分析借助PANTHER和Reactome数据库，蛋白–蛋白相互作用（PPI）网络通过STRING数据库（版本12.0）构建。所有蛋白质组学实验均设三次重复。细胞系来源为美国典型培养物保藏中心（ATCC）的人源U87 GBM细胞系（MG亚型，ATCC HTB-14）。
**3. 研究结果**
**3.1 ATRA和姜黄素对细胞增殖的影响**
研究发现，在24小时时间点，低剂量ATRA和姜黄素单药均可促进细胞生长，其中姜黄素的促增殖作用更为显著。在联合用药组中，低剂量姜黄素（5和10 μM）对ATRA在25和50 μM剂量下的抗肿瘤效应表现出强烈拮抗作用（CI值超过10）。然而，当ATRA剂量达到50 μM或更高时，与姜黄素联用可产生协同抑制细胞生长的效应，且该协同作用随时间显著增强。ATRA（75 μM）与姜黄素（20 μM）联合用药的CI值低于0.1，表明在72小时时存在强协同作用。该剂量组合被用于后续细胞死亡和蛋白质组学实验。
**3.2 ATRA和姜黄素对细胞迁移的影响**
所有处理组均抑制U87 GBM细胞迁移，其中联合处理组自1小时起便表现出最持续且显著的抑制作用。至72小时，联合组的归一化细胞指数（NCI）值稳定在约0.35，低于ATRA（约0.55）和姜黄素（约0.65）单药组，表明联合方案具有协同抗迁移活性。
**3.3 ATRA和姜黄素对细胞死亡的影响**
流式细胞术分析显示，对照组94.3%细胞存活。ATRA和姜黄素单药处理分别导致53.3%和56.3%的细胞进入早期凋亡，但晚期凋亡率相对较低（分别为13.5%和6.92%）。联合处理显著增加晚期凋亡率至23.2%，并伴随细胞活力的明显下降，提示细胞协同通过凋亡阶段进展，最终导致细胞膜完整性丧失。
**3.4 差异表达蛋白的鉴定**
定量蛋白质组分析在48小时和72小时分别鉴定出1457和1723个蛋白。火山图分析显示，在48小时，ATRA、姜黄素和联合组分别有13、14和44个差异表达蛋白；在72小时，分别有31、37和156个差异表达蛋白。结果表明，单独用药仅影响相对有限的蛋白质组，而联合处理则改变了更为广泛的蛋白质表达谱。
**3.5 分子功能与通路分析**
基因本体（GO）分析表明，结合活性和催化活性在所有药物组及时间点中占比超过25%。在48小时，联合组的通路分布较单药组更为广泛。在72小时，ATRA与联合组在帕金森病和亨廷顿病通路中均有富集，且与神经退行性变相关。姜黄素和联合组在CCKR、GnRH、整合素和炎症通路上存在重叠。这些结果被解读为强烈细胞应激的发生。
**3.6 关键个体蛋白的差异表达**
通过严格的筛选标准（|Log2FC| ≥ 3或差异倍数≥9，FDR = 0.01），共鉴定出11个最显著的蛋白。ATRA显著降低腱糖蛋白（tenascin）、转化生长因子β诱导蛋白（TGFBI）、磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）、核结合蛋白2（NUCB2）和死骨片1（SQSTM1）的水平。姜黄素减轻了ATRA对TGFBI和PHGDH的下调作用，完全逆转了对腱糖蛋白的影响，但增强了ATRA对SQSTM1的下调效应。Sad1和UNC84结构域包含蛋白2（SUN2）在单药组中表达升高，在联合组中消失。葡萄膜自身抗原含卷曲螺旋结构域和锚蛋白重复序列（UACA）、跨膜9超家族成员2（TM9SF2）和核糖体蛋白L37a（RPL37A）在各组中均升高。己糖激酶2（HXK2）仅在姜黄素及联合组中升高。血红素加氧酶1（HMOX1）在联合组中显著降低，而单药组无变化。
**3.7 蛋白–蛋白相互作用网络**
STRING数据库分析显示，ATRA处理组在48小时的PPI网络涉及丝氨酸合成（PSAT1-PHGDH）及氧化还原/核糖体功能（PRDX1-RPSA）。联合组在48小时以热休克蛋白HSPA4为核心枢纽。在72小时，ATRA组形成以组蛋白H3.3（H3-3B）和PHGDH为核心的网络，以及涉及CUL1/NEDD8/SQSTM1的蛋白降解网络。姜黄素组形成核糖体蛋白和RNA加工因子构成的紧密网络，以及涉及DNA复制修复（MCM5、MCM7、POLD1、DTYMK）和抗氧化（SOD1、TXNRD1、PRDX5、AKR1C1）的簇。联合组的网络最为庞大且连接紧密，涉及核糖体、DNA复制、细胞周期和氧化还原调控，随时间推移呈现更复杂的交互状态。
**4. 讨论与结论总结**
讨论部分指出，低剂量药物诱导的细胞增殖与相互拮抗符合毒物兴奋效应概念。ATRA初始通过激素样效应刺激代谢和生长，而姜黄素诱导更强的毒物兴奋效应，表现为更显著的生长刺激和对抗伴侣药物抗肿瘤作用的抑制。高剂量单药作用时蛋白质组变化集中且有限，而联合治疗则引发大量蛋白质通路的高度多样化，此现象提示细胞可能首先分散抗性途径以自我保护，但过度多样化更可能反映细胞应激反应协调性的丧失，而非适应性保护。TGFBI、腱糖蛋白和PHGDH的降低与ATRA的抗增殖和抗迁移活性相符。SQSTM1和HMOX1的下调可能构成ATRA与姜黄素协同抗癌效应的关键因素。相反，RPL37A、TM9SF2和HXK2的升高提示部分合成代谢或毒物兴奋途径仍持续存在。
本研究得出结论：将复杂的耐药机制归纳为毒物兴奋效应与抗癌协同效应等概念性框架，有助于理解药物产生相反生物学效应的原因，从而优化实验设计、指导早期临床试验并筛选优势获益人群。该研究为ATRA与姜黄素联合治疗GBM提供了机制层面的见解，其发表在《International Journal of Molecular Sciences》。研究的主要局限性在于使用了单一GBM细胞系，未来需在患者来源的多种GBM模型中验证。xCELLigence实时阻抗分析系统作为增殖和迁移检测手段，相较于传统终点法（如MTT、CCK-8和划痕实验）提供了更动态的细胞行为信息，构成该研究的方法学优势。
